Hotstart Taq DNA聚合酶

Hot start Taq DNA聚合酶是一种创新型的化学修饰热启动酶，该酶在室温下活性被完全封闭，依赖温度激活酶活性，可有效减少非特异性扩增，具有非常高的特异性。扩增片段长度可达5 kb（简单模板）。延伸速率为2min/kb（70-75℃，简单模板可达20s/kb）。该酶具有5'→3'聚合酶活性，无3'→5'外切酶活性。扩增产物具有3'-dA末端。Hotstart Taq DNA聚合酶采用先进的化学修饰技术生产，动物源性DNA污染为零，稳定性更强，具有抗体法热启动酶不可比拟的优势。同时，预变性时间缩短至3分钟，工作效率比大多数化学修饰法热启动酶更高，是一款非常新颖、实用的产品。

产品组成

Component	P1041 250U	P1042 1,000U	P1043 3,000U	P1044 18,000U
Hot start Taq DNA聚合酶（5U/μl）	50 μl	200 μl	200 μl × 3	100 μl× 36
10× Hot start Buffer（Mg2+ Plus）[1]	1.25 ml	1.25 ml× 2	1.25 ml × 6	1.25 ml × 36
6× Loading Buffer[2]	1 ml	1 ml	1 ml	-

[1] 10× Hot start Buffer分为Mg²⁺ Plus与Mg²⁺ Free两种包装，可方便选择。如无特别说明提供Mg²⁺ Plus缓冲液。Mg²⁺ Free的10× Hot start Buffer提供25 mM MgCl₂。 本产品不含dNTPs，如有需要请单独购买

活性定义

一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存条件

-20℃保存2年。

质量控制

纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能检测：PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。 应用举例
1. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系，体系大小与组分用量与添加顺序可调整：

Ordinal	Component	Volume(50 μl reaction volume)	Final   concentration(50 μl reaction volume)
1	10× Hotstart Buffer（Mg2+Plus）	5 μl	1×
2	dNTPs（2.5mM）	4 μl	0.4 mM
3	upstream primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4 μM
4	downstream primer (10 μM)[1]	2 μl	0.4 μM
5	Optimus™ Hotstart Taq   DNA聚合酶（5U/μl）[2]	0.5 μl-1 μl	2.5U-5U
6	template DNA[3]	1-4 μl	<1μg
7	超纯水	To 50 μl	-
optional	MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]	Variable	-

[1] 引物终浓度建议范围：0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度，效率低时可提高浓度。
[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。
[3] 不同模板最佳用量不同，部分DNA模板建议用量如下表（50 μl反应体系）

Template	Dosage
人类基因组DNA	0.1μg-1μg
λDNA	0.5ng-5ng
大肠杆菌基因组DNA	10ng-100ng
质粒DNA	0.1ng-10ng

2. 设定反应程序进行PCR反应

Stage	Temperature	Time	Number of Cycles
Initial Denaturation	94℃	3 min	1
Denaturation	94℃	30 sec	25-35
Annealing	55-68℃[1]	30 sec
Extension	72℃	Variable[2]
Final Extension	72℃	5-10 min	1

[1] 退火温度应根据Tm值较低的引物来设。
[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳（简单模板可达20s/kb）。
3. 分析结果
将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要，可进行割胶回收。

无产物或产物量少的改进措施有：1调整退火温度；2减少抑制剂的影响，如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分，需要高倍稀释（1: 10000）后使用；3采用乙醇沉降洗脱，提高模板DNA的纯度；4使用PCR添加剂，如PCR Enhancer、MgCl₂等可提高产量。

操作注意事项

1 本产品采用改进的化学修饰技术，依赖温度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特异性结合，可在室温下配置反应体系。

2 Hot start Taq DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性，因此在PCR产物3'末端通常会加上1个多余的脱氧腺嘌呤核苷，可直接用于TA克隆。

引物设计注意事项

引物长度一般在15-30个碱基之间；上下游引物3’末端避免互补，避免出现3个以上重复的G或C，或出现发夹结构，否则会产生非特异性扩增；GC含量控制在40-60%，且上下游引物GC含量尽量接近；Tm值控制在55-65 ℃之间，且上下游引物Tm值尽量接近，额外附加序列（酶切位点、修饰等）是非模板匹配序列，不参与Tm值计算。