
Hotstart Taq DNA聚合酶
供应商货号:P1041,P1042,P1043,P1044
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产品组成
Component |
P1041 250U |
P1042 1,000U |
P1043 3,000U |
P1044 18,000U |
Hot start Taq DNA聚合酶(5U/μl) |
50 μl |
200 μl |
200 μl × 3 |
100 μl× 36 |
10× Hot start Buffer(Mg2+ Plus)[1] |
1.25 ml |
1.25 ml× 2 |
1.25 ml × 6 |
1.25 ml × 36 |
6× Loading Buffer[2] |
1 ml |
1 ml |
1 ml |
- |
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。保存条件
-20℃保存2年。质量控制
纯度检测:经质量检测,产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。功能检测:PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因。 应用举例 Volume(50 μl reaction
volume) Final concentration(50 μl reaction
volume)
1. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系,体系大小与组分用量与添加顺序可调整:
[1] 引物终浓度建议范围:0.1-1 μM。特异性差时可降低浓度,效率低时可提高浓度。Ordinal
Component
1
10× Hotstart Buffer(Mg2+Plus)
5 μl
1×
2
dNTPs(2.5mM)
4 μl
0.4 mM
3
upstream primer (10 μM)[1]
2 μl
0.4 μM
4
downstream primer (10 μM)[1]
2 μl
0.4 μM
5
Optimus™ Hotstart Taq DNA聚合酶(5U/μl)[2]
0.5 μl-1 μl
2.5U-5U
6
template DNA[3]
1-4 μl
<1μg
7
超纯水
To 50 μl
-
optional
MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[5]
Variable
-
[2] 根据目的片段扩增的难易程度调整DNA聚合酶的用量。
[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建议用量如下表(50 μl反应体系)
Template
Dosage
人类基因组DNA
0.1μg-1μg
λDNA
0.5ng-5ng
大肠杆菌基因组DNA
10ng-100ng
质粒DNA
0.1ng-10ng
2. 设定反应程序进行PCR反应
Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
Denaturation |
94℃ |
30 sec |
25-35 |
Annealing |
55-68℃[1] |
30 sec |
|
Extension |
72℃ |
Variable[2] |
|
Final Extension |
72℃ |
5-10 min |
1 |
[2] 延伸时间按2min/kb来设最佳(简单模板可达20s/kb)。
3. 分析结果
将产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。如有需要,可进行割胶回收。
无产物或产物量少的改进措施有:1调整退火温度;2减少抑制剂的影响,如提取的基因组DNA中含有抑制扩增的成分,需要高倍稀释(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脱,提高模板DNA的纯度;4使用PCR添加剂,如PCR Enhancer、MgCl2等可提高产量。
操作注意事项
1 本产品采用改进的化学修饰技术,依赖温度激活DNA聚合酶,能有效抑制非特异性结合,可在室温下配置反应体系。2 Hot start Taq DNA聚合酶具有脱氧核苷酸转移酶活性,因此在PCR产物3'末端通常会加上1个多余的脱氧腺嘌呤核苷,可直接用于TA克隆。
引物设计注意事项引物长度一般在15-30个碱基之间;上下游引物3’末端避免互补,避免出现3个以上重复的G或C,或出现发夹结构,否则会产生非特异性扩增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量尽量接近;Tm值控制在55-65 ℃之间,且上下游引物Tm值尽量接近,额外附加序列(酶切位点、修饰等)是非模板匹配序列,不参与Tm值计算。
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