GB4789.11-2014β型溶血性链球菌检验-微生物官网

行业应用

联系我们

联系人：客服中心
电话：400-878-7248
Email：info@biocomma.cn
网址：www.biocomma.cn
地址：
深圳市龙岗区吉华街道甘李六路12号中海信创新产业城12栋1楼

GB4789.11-2014β型溶血性链球菌检验

一、概述
1.1 适用范围
本标准规定了食品中β型溶血性链球菌(Streptococcus)检验的检验方法。本标准适用于食品中β型溶血性链球菌的检验。
第三篇致病菌检验
1.2检测原理
β型溶血性链球菌呈球形或卵圆形，直径0.6~1.0μm,呈链状排列，长短不一，由4~8个至20~30个细胞组成不等，需氧或兼性厌氧菌，营养要求较高，普通培养基上生长不良，需补充血清、血液等生长因子。最适生长温度为37℃,在20~42℃能生长，最适pH为7.4~7.6。在血清肉汤中易成长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5~0.75mm的细小菌落，能产生链球菌溶血素O/S,所以能在血平板上出现溶血环。该菌具有过氧化氢酶，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。β型溶血性链球菌在代谢过程中，产生链激酶，能激活血液中的纤维蛋白酶原为溶纤维蛋白酶，促使纤维蛋白凝块溶解。

二、设备与耗材
2.1 设备
2.1.1恒温培养箱36℃±1℃。
2.1.2冰箱2~5℃。
2.1.3厌氧培养装置。
2.1.4天平感量0.1g。
2.1.5 均质器。
2.1.6显微镜 100~1000倍。
2.1.7无菌吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸头。
2.1.8无菌锥形瓶容量100ml、200ml、2000ml。
2.1.9无菌培养皿直径90mm。
2.1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.1.11 水浴装置36℃±1℃。
2.1.12微生物生化鉴定系统。
2.1.13涡旋混匀仪。
2.2耗材
2.2.1均质袋。
2.2.2生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。
2.2.3厌氧产气袋。
2.2.4均质杯。
2.2.5接种环。
2.2.6载玻片。

三、培养基与试剂
3.1 培养基
3.1.1改良胰蛋白胨大豆肉汤(Modified tryptone soybean broth,mTSB)。
3.1.2哥伦比亚CNA血琼脂(Columbia CNA blood agar )。
3.1.3哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar )。
3.1.4胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soybean broth,TSB)。
3.2试剂
3.2.1革兰染色液。
3.2.2草酸钾血浆。
3.2.3 0.25%氯化钙(CaCl₂)溶液。
3.2.4 3%过氧化氢(H2O₂)溶液。

四、检验过程
4.1 检验程序

4.2检验步骤
4.2.1 样品前处理及增菌按无菌操作称取检样25g(mL),加入盛有225ml mTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1~2分钟；或加入盛有225mL mTSB的均质杯中，以8000~10000r/min均质1~2分钟。若样品为液态，振荡均匀即可。36℃±1℃培养18~24小时。
4.2.2分离将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板，36℃±1℃厌氧培养18~24小时，观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径2~3mm,灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生β型溶血。

4.2.3鉴定
4.2.3.1 分纯培养挑取5个(如小于5个则全选)可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃培养18~24小时。
4.2.3.2革兰染色镜检挑取可疑菌落染色镜检。β型溶血性链球菌为革兰染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状。
4.2.3.3触酶试验挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量3%过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。β型溶血性链球菌触酶为阴性(见下图)。

4.2.3.4链激酶试验(选做项目)吸取草酸钾血浆0.2mL于0.8mL 0.85%无菌生理盐水中混匀，再加入经36℃±1℃培养18~24小时的可疑菌的TSB培养液0.5mL及0.25%氯化钙溶液0.25mL,振荡摇匀，置于36℃±1℃水浴中10分钟，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。继续36℃±1℃培养24小时，凝固块重新完全溶解为阳性，不溶解为阴性，β型溶血性链球菌为阳性。

4.2.3.5其他检验使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。
4.3结果与报告
综合以上试验结果，报告每25g(mL)检样中检出或未检出溶血性链球菌。

五、检验注意事项
5.1 设备与耗材的控制与使用
5.1.1 实验室的设备和耗材入库时，应该对产品的质量进行验收，确保产品内外密封性、无潮湿、完好无损，产品规格、型号相符，且在有效期内。
5.1.2 为了保证试验结果的准确性，每批次一次性耗材均应进行无菌性和性能验收。同时实验室应定期对洁净区、生物安全柜、超净工作台等进行环境监测。
5.1.3实验用的一次性无菌耗材应存放于阴凉干燥、通风良好的物架上，常温区域为10~30℃,阴凉区域为不高于20℃,相对湿度为40%~65%。按失效期的先后顺序码放，禁止与其他物品混放，不得使用标识不清、包装破损、失效、霉变的耗材。
5.1.4为了控制环境污染，可在每次检验过程中，于检验工作台上打开两块TSA平板，并在检验环境中暴露不少于15分钟，将此平板与本批次样品同时进行培养，以掌握检验过程中是否存在来自检验环境的污染。
5.2培养基与试剂的控制与使用
5.2.1 定期用GB4789.28推荐的阳性和阴性对照标准菌种，对所使用的每批次培养基和生化试剂进行验证，并进行记录。
5.2.2实验过程中，每批样品选择性增菌液、哥伦比亚CNA血琼脂平板等都要做空白对照。如果空白对照平板上出现β型溶血性链球菌菌落时，应废弃本次实验结果，并对增菌液、吸管、平皿、培养基、实验环境等进行污染来源分析。
5.2.3定期使用β型溶血性链球菌标准菌株或相应定量活菌质控品，在BSL-Ⅱ生物安全实验室或阳性对照实验室内，用适当的食品样品进行阳性对照试验验证，染菌剂量应控制在每25g样品10~100CFU,并进行记录。
5.2.4哥伦比亚CNA血琼脂平板应2~8℃冷藏保存，开封后尽快使用完毕。
5.3样品前处理
液体样品先用NaOH或HCl调节pH至6.5~7.5。
5.4增菌培养
5.4.1 使用均质袋进行增菌培养时，应使用带有底托的均质袋架子，防止培养过程中前增菌液泄露污染培养箱。
5.4.2当样品为易产生较大颗粒的样品(譬如肉与肉制品)时，可使用带滤网无菌均质袋，以方便均质后用吸管吸取匀液。
5.5菌落特征
哥伦比亚CNA血琼脂平板上如有β型溶血性链球菌落出现，应与金黄色葡萄球菌区别。后者在哥伦比亚CNA血琼脂平板上，菌落较大，呈金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。β型溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上呈灰白色、半透明或不透明、光滑、表面突起、边缘整齐，周围有无色透明溶血圈。
5.6其他注意事项
5.6.1 厌氧环境下(10%二氧化碳和90%氮气),哥伦比亚CNA血琼脂平板比普通血琼脂平板更适合β型溶血性链球菌的分离培养，主要表现为菌落形态典型、溶血显现更为明显，同时抑制了需氧菌及干扰菌的生长，从而提高辨别率，利于该菌的分离和筛选。
5.6.2 触酶实验中的3%过氧化氢溶液应现配现用；用一次性塑料接种环挑取菌落；不宜用血琼脂平板上生长的菌落，因红细胞含有触酶，可致假阳性反应。
5.6.3因β型溶血性链球菌对消毒剂的抵抗力较低，远低于大肠杆菌对消毒剂的抵抗力。因此，培养室应尽量减少消毒剂残留对β型溶血性链球菌的生长影响(尽量选用一次性培养皿)。
5.6.4在使用VITEK2 Compact全自动微生物分析系统进行鉴定时，应结合其他生物学特性综合评价后判断结果。如遇待检菌鉴定评分过低、多个生化反应结果不符或48小时生化反应仍不明显的情况，应考虑与链球菌乳化程度不够、呈颗粒状，不能形成均匀的菌悬液有关，此时应重复试验或改用其他方法鉴定，如API20STREP快速生化鉴定系统。
5.6.5本方法移液时可使用可连接吸管的电动移液器，在使用过程中，一旦液体进入电动移液器滤膜中，应立即对滤膜进行更换，以防止交叉污染。
5.6.6 鉴于微量移液器移液头较短，为控制污染，在本方法移液过程中不建议使用。

六、疑难解析
6.1 β型溶血与α型溶血在观察时有什么区别?
β型溶血：菌落周围出现较宽的透明溶血环；a型溶血：菌落周围出现较窄的草绿色溶血环。
6.2 β型溶血性链球菌和乙型溶血性链球菌是一种菌吗?是的，同一种菌的不同名称。
6.3为什么β型溶血性链球菌实验要在生物安全柜中操作?
β型溶血性链球菌可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、黏膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也可能会感染人，且该菌致病力强，应做好相应的个人防护，在生物安全柜中进行实验操作。
6.4在医院抽了自己的血做链激酶试验，血浆无法凝固?医院用来抽血的小试管中已经有抗凝剂，一般是EDTA,这个不能做链激酶试验。
6.5草酸钾血浆该怎么配制?
直接有商品化的购买，如果买不到，由现在医院抽血加入到含0.01g草酸钾的真空试管，然后上下振摇使其混合均匀。

参考文献
[1]张焕春.临床微生物学和微生物检验[M].北京：人民卫生出版社，2017.

附录A

胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)

1、产品用途：可广泛应用于细菌的培养，特别用于消毒剂消毒效果的测试、蜡样芽孢杆菌的多管发酵法测定、溶血性链球菌选择性增菌培养。
2、检验原理：胰蛋白胨、植物蛋白胨提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖提供碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠维持均衡的渗透压。
3、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB)验证数据

5、验证结果小结：
1、生长率：目标菌 β-溶血性链球菌CMCC(B)32210 、金黄色葡萄球菌 ATCC6538，逗点、L品牌、H品牌的混浊度、生长现象均满足要求；
2、感观：逗点、L品牌、H品牌外观颜色无明显差异。

附录B

哥伦比亚CNA血琼脂

1.产品用途：用于溶血性链球菌的选择性分离。
2.检验原理：胰酪蛋白胨、动物组织蛋白酶消化液、酵母提取粉、牛肉提取粉、淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子；琼脂是凝固剂。配制添加羊血是细菌生长繁殖的良好营养物质。在45～50℃的基础培养基中加入血液可以保存血液中某些不耐热的生长因子，同时血球不被破坏。多粘菌素B、萘啶酸能抑制杂菌生长。
3、哥伦比亚CNA血琼脂验证

5、验证结果小结：
验证结果小结
1.生长率：目标菌化脓性链球菌ATCC19615，逗点、L品牌、H品牌均满足国标PR≥0.5的要求，逗点、H品牌、L品牌都有产生β型溶血。
2.选择性：普通变形杆菌CMCC(B)49027、大肠埃希氏菌ATCC25922，逗点、L品牌、H品牌均满足国标G≤1的要求。
3.感观：三家外观暂无明显差异。

附录C

哥伦比亚血琼脂验证

1.产品用途：用于苛养和非苛养型细菌的培养，以及溶血性细菌的鉴别
2.检验原理：酪蛋白胰酶消化物、心胰酶消化物、肉胃酶消化物、酵母浸出粉、可溶性淀粉提供碳氮源、维生素和生长因子；羊血是细菌生长繁殖的良好营养物质。在45～50℃的基础培养基中加入血液可以保存血液中某些不耐热的生长因子，同时血球不被破坏。
3、哥伦比亚血琼脂验证

5、验证结果小结：
1.特异性：目标菌金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、蜡样芽胞杆菌 CMCC(B)63303，逗点、L品牌、H品牌均满足国标生长特性溶血现象的要求，逗点、H品牌溶血现象明显，L品牌溶血现象较弱。逗点生长速度较缓慢。
2.感观：逗点、L品牌、H品牌外观颜色无明显差异。
3.三家产品无明显差距。添加的羊血影响产品的主要性能，以上验证和仅有两种质控菌并不能充分判别干粉质量的好坏。

GB 4789.14-2014蜡样芽胞杆菌检验

GB 4789.39-2013粪大肠菌群计数

GB 4789.7-2013副溶血性弧菌检验及注意事项

GB 4789.38-2012大肠埃希氏菌计数

GB 4789.5-2012志贺氏菌检验及注意事项

GB4789-30-2016单核细胞增生李斯特氏菌检验及注意事项

GB4789.11-2014β型溶血性链球菌检验

GB4789.8-2016小肠结肠炎耶尔森菌检验

GB4789.6-2016致泻大肠埃希氏菌检验及注意事项

GB4789.10-2016金黄色葡萄球菌的检验及注意事项

GB4789.15-2016霉菌酵母计数

GB4789.2-2022菌落总数测定及注意事项

GB4789.4-2016沙门氏菌检验及注意事项

GB4789.3-2016大肠菌群计数及注意事项

GB4789.11-2014β型溶血性链球菌检验

服务热线：

400-878-7248