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GB 4789.7-2013副溶血性弧菌检验及注意事项

一、副溶血性弧菌的生物学特性
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)属于弧菌科弧菌属，革兰氏阴性，无芽孢，呈弧状、杆状、卵圆状等多种形态，单端鞭毛;兼性厌氧菌，嗜盐、对葡萄糖、甘露醇、麦芽糖等发酵产酸。
流行学特征
主要存在于温带地区海水、海水沉积物和鱼虾、贝类等海产品中，是沿海国家及地区食品中毒的主要致病菌，主要污染水产制品或交叉污染肉制品等其他食品，人食用这些生、半生或交叉污染的海产品可能导致急性肠胃炎、关节炎等，有时甚至引起原发性败血症。
副溶血性弧菌的检验

二、检验步骤

三、操作步骤
3.1 样品制备
3.1.1 非冷冻样品采集后应立即置 7 ℃～10 ℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在 45 ℃以下不超过 15 min 或在 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。
3.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。
3.1.3 以无菌操作取样品 25 g（mL），加入 3%氯化钠碱性蛋白胨水 225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min 均质 1 min，或拍击式均质器拍击 2 min，制备成 1:10 的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自 225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入 500 mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品 1～2 次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备 1:10 的样品匀液。
3.2 增菌
3.2.1 定性检测
将 3.1.3 制备的 1:10 样品匀液于 36 ℃ ±1 ℃培养 8 h ～ 18 h。
3.2.2 定量检测
3.2.2.1 用无菌吸管吸取 1:10 样品匀液 1 mL，注入含有 9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备 1:100 的样品匀液。
3.2.2.2 另取 1 mL 无菌吸管，按 5.2.2.1 操作程序，依次制备 10 倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支 1 mL 无菌吸管。
3.2.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择 3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种 3 支含有 9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种 1 mL。置 36 ℃ ±1 ℃恒温箱内，培养 8 h ～ 18 h。
3.3 分离培养
对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm 内沾取一环增菌液，于TCBS 平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36℃ ±1℃培养18h ～ 24h。典型的副溶血性弧菌在TCBS 上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm ～ 3mm。从培养箱取出TCBS 平板后，应尽快（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。
3.3.1、氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
3.3.2、涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。
3.3.3、挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3% 氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃ ±1℃培养24h 观察结果。副溶血性弧菌在3% 氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。
3.3.4、嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8% 和10% 不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃ ±1℃培养24h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10% 氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6% 氯化钠和8% 氯化钠的胰胨水中生长旺盛。继续进行下列有关试验。
3.3.5、生化试验：取纯培养物分别接种含3% 氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP 培养基，36℃ ±1℃培养24h ～ 48h 后观察结果；3% 氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG 试验。

操作注意事项
1、样本在收集后应该立即被冷却(7~10° C)，然后尽快检验，
2、带贝壳类或甲壳类样品前处理时，应先在符合生活饮用水卫生标准的流水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳后取样;
3、注意分离时所选增菌液的部位，副溶血性弧菌在3% 氯化钠碱性蛋白胨水中增菌后呈均匀混浊生长，培养基表面容易形成菌膜，分离时，要求“液面以下1cm 内“在这个范围内，应该目标菌最多、没有干扰的区域;
4、一般样品中含有多种弧菌比较常见，分离时一定要在平板上多级稀释划线，不要一条线划线到底，培养出来发现没有分开。

3.4 培养基原理解析
3% 氯化钠碱性蛋白胨水
蛋白胨提供碳源、氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠和高pH 值可以抑制非弧菌类细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长。

3.5 硫代硫酸盐- 柠檬酸盐- 胆盐- 蔗糖（TCBS）琼脂
• 配方中多价蛋白胨、酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子；氯化钠可刺激弧菌的生长；蔗糖是可发酵的糖类；胆酸钠、牛胆汁粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH 可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴麝香草酚蓝和麝香草酚蓝是pH 指示剂；琼脂是培养基的凝固剂。
• 副溶血性弧菌不发酵蔗糖，不会使培养基pH 降低，因而在该培养基上为绿色菌落，创伤和拟态弧菌都不发酵蔗糖，需进一步确证鉴定，霍乱弧菌发酵蔗糖为黄色。
3.6 弧菌显色培养基
• 配方中蛋白胨和酵母膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；蔗糖为可发酵的糖类；抑菌剂抑制大部分非弧菌细菌，氯化钠可维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；混合色素与副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上产生品红色菌落( 副溶血性弧菌) 和绿- 蓝绿色的菌落( 霍乱弧菌和创伤弧菌)。

3.7 3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂
• 胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠可以抑制非弧菌类细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长；琼脂为凝固剂。

3.8 氧化酶试验
原理：氧化酶使细胞色素C 氧化，氧化型细胞色素C 再氧化对苯二胺试剂形成紫色复合物，产生颜色反应。
操作：滴加1 滴氧化酶试剂到一小块洁净滤纸上，用玻棒或接种环（铂或塑料）挑取适量新鲜菌苔涂在试剂润湿的纸片上；30 秒内出现蓝紫色为阳性，延迟反应或无颜色变化为阴性

3.9 3％氯化钠三糖铁琼脂
• 蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、维生素、矿物质；乳糖、葡萄糖、蔗糖为可发酵糖类，其产酸时通过酚红指示剂测出，酸性呈黄色，碱性呈红色；硫代硫酸钠可被某些细菌还原为硫化氢，与硫酸亚铁中的铁盐生成黑色硫化铁；较高含量的氯化钠维持弧菌均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。

附录A

3% 氯化钠碱性蛋白胨水验证

1、产品用途：用于副溶血性弧菌增菌培养。
2、检验原理：蛋白胨提供碳源、氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠和高pH 值可以抑制非弧菌类细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长。

表8-1 ：3% 氯化钠碱性蛋白胨水验证。

3、典型特征图片：

4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌副溶血性弧菌 ATCC17802，L 品牌、 H 品牌、逗点均满足国标在弧菌显色培养基平板上＞ 10CFU，品红色菌落。L 品牌目标菌生长率最好，H 品牌最差，逗点生长率在 L 品牌、H 品牌之间。
4.2 选择性：大肠埃希氏菌ATCC25922，逗点均符合国标在TSA 上＜ 100CFU 要求，L 品牌、H 品牌不符合国标在TSA 上＜ 100CFU 要求。

附录B

弧菌显色培养基验证

1. 产品用途：用于弧菌特别是副溶血性弧菌的分离和初步鉴定。
2. 检验原理：蛋白胨和酵母膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；蔗糖为可发酵的糖类；抑菌剂抑制大部分非弧菌细菌，氯化钠可维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；混合色素与副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌所对应的酶发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，在淡黄色平板上产生品红色菌落( 副溶血性弧菌) 和绿- 蓝绿色的菌落( 霍乱弧菌和创伤弧菌)。

表8-2 ：弧菌显色培养基验证

3、典型特征图片：

4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌副溶血性弧菌 ATCC17802、逗点、H 品牌均满足国标PR ≥ 0.7 的要求。H 品牌菌落生长速度更快；
4.2 选择性：大肠埃希氏菌 ATCC25922，逗点、H 品牌均满足国标G ≤ 1 的要求；
4.3 特异性：霍乱弧菌 VbO 、溶藻弧菌 ATCC33787 逗点、H 品牌均满足菌落颜色特征要求
4.4 感观：两家平板颜色无显著差异。

附录C

3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂培养基验证

1. 产品用途：用于副溶血性弧菌的培养。
2. 检验原理：胰蛋白胨、大豆蛋白胨提供氮源、维生素、生长因子；高含量氯化钠可以抑制非弧菌类细菌生长，不影响副溶血性弧菌生长；琼脂为凝固剂。

表8-3 ：3% 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂培养基验证

3、典型特征图片：

4、验证结果小结：
4.1 生长率：目标菌副溶血性弧菌 ATCC17802、创伤弧菌落 ATCC 27562，逗点、L 品牌、H 品牌均满足国标PR ≥ 0.7 的要求；
4.2 感观：三家平板颜色无显著差异。

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