一、样品提取

准确称取经粉碎的茶叶1.0 g于50 mL离心管中，加入浓度为 10 μg/mL草甘膦内标100 μL，再加入10 mL 水，涡旋混匀15 min，超声提取15 min，以10000 r/min离心5 min，待净化。

二、净化

移取 5 mL 上清液至 15 ml 离心管中，加 5 ml 二氯甲烷，移取5 mL上清液至50 mL 离心管中，加入5 mL二氯甲烷，涡旋混匀5 min，以10000 r/min离心5 min，取2.5 mL上清液过固相萃取柱（使用前用3 mL甲醇和3 mL水活化），弃掉前端几滴液体，再收集后续流出液，待衍生。

三、衍生

取1.0 mL 上述的净化液，加入0.2 mL 50 g/L 硼酸钠缓冲溶液，涡旋混匀，再加入0.2 mL 10 g/L FMOC-Cl 丙酮衍生液，涡旋混匀后置于45 ℃下衍生2 h，以10000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤膜，上机测试。

四、标曲配制

吸取一定量的混合标准溶液和同位素内标溶液，用水稀释定容至1.0 mL，使每毫升混合标准工作液含有同位素内标100 ng/mL。加入 50 g/L 硼酸钠缓冲溶液0.2 mL，混匀，再加入10 g/L FMOC-Cl溶液0.2 mL，涡旋混匀后同样品置于45 ℃下衍生2 h，配制成上机浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。

五、仪器条件（Thermo Fisher TSQ Endura）

液相部分：

色谱柱：Commail^® BEH T-C18(2.1 mm×100 mm,3 μm)

流动相：A：5 mmol/L乙酸铵溶液  B：乙腈

流速：0.4 mL/min   柱温：30℃   进样量：5 μL

洗脱程序：梯度洗脱表1

质谱条件
离子源：HESI
电喷雾电压：3500 V
鞘气压力：40 arb
辅气压力：10 arb

离子传输管：260℃
辅气温度：350℃

表 2 组分名称、保留时间及特征离子一览表（* 为定量离子）

五、实验结果

5.1测试数据

5.2测试色谱图

图 1 添加水平 0.50mg/kg 的铁观音总离子流图

六、实验过程分析

6.1衍生剂浓度

如图2所示，考察衍生剂浓度分别为1g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L和20g/L，添加量为0.2 mL时标液中目标物的峰面积变化，从图中可以看出衍生剂加入量≥6g/L时，目标物峰面积无明显变化。考虑到样本中的基质会消耗一定量的衍生剂，建议适当增大衍生剂的浓度，方案中衍生剂的浓度为10 g/L。

6.2衍生时间

考察不同衍生时间，0.5~4小时（衍生温度40℃）及12小时（室温过夜20 ℃）。结果如图3所示，草甘膦和氨甲基磷酸在衍生时间≥2小时，目标物峰面积无明显变化，室温过夜有利于衍生完成。综合考虑时效性，方案中衍生时长为2小时。

图3 衍生时间对目标物的影响

6.3衍生温度

考察不同温度对衍生的影响，衍生温度大于35 ℃时，草甘膦和氨甲基膦酸以及内标的峰面积无太大差异，方案中选择45℃为衍生温度。

图4 衍生温度对目标物的影响

6.4硼酸钠浓度

如图5，不同浓度硼酸钠缓冲溶液对草甘膦和氨甲基膦酸以及内标的衍生影响较小，50g/L硼酸钠缓冲溶液已经能获得较为理想的衍生效果，而浓度高的硼酸钠溶液会污染质谱，方案采用50g/L的硼酸钠。

图5 硼酸钠浓度对目标物的影响

6.5衍生剂存储时间

考察不同存储时间的FMOC-Cl对目标物的影响，实验结果如图6所示。FMOC-Cl存储时间对于草甘膦及其内标影响较小，但对氨甲基膦酸有显著影响，储存时间越长峰面积越小。

图6 衍生剂存储时间对目标物的影响

说明：

1.不同类型的茶叶所含干扰基质不一样，实际处理时可对方法进行适当调整，如对颜色深的提取液可多次加入二氯甲烷净化，且在衍生时提高衍生剂的浓度。

2.前处理中可加入微量饱和醋酸铅溶液（如20 μL）,用于沉淀酚类干扰物，此时可获得较为澄清的上机溶液。值得注意的是，醋酸铅的加入会导致氨甲基磷酸响应变低，但不会影响草甘膦的响应，可综合考虑选择性使用。

3.仪器条件优化，草甘膦和氨甲基磷酸受基质抑制影响严重，灵敏度低的仪器在优化时很难找到相应的母离子，此时，可直接参考文献或者标准输入同类型仪器的参数。

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