大肠菌群和大肠埃希氏菌菌落计数方法概述

大肠菌群和大肠埃希氏菌是食品、水质和环境卫生检测中常用的指示微生物。二者名称相近，但含义不同。大肠菌群是一组在一定条件下能发酵乳糖、产酸产气的革兰氏阴性、无芽孢杆菌，主要用于评价食品或环境样品的卫生状况；大肠埃希氏菌则是大肠菌群中的重要成员之一，更常作为粪便污染或卫生风险评价的指示菌。因此，在检测和结果表达时，不能把“大肠菌群计数”直接写成“大肠杆菌计数”，也不能把紫红胆盐乳糖琼脂上的典型红色菌落直接判定为大肠埃希氏菌。

食品微生物检验中，大肠菌群常用MPN法、平板计数法或测试片法进行计数；大肠埃希氏菌可采用MPN法、平板计数法或含酶底物的计数体系进行检测。不同方法适用场景不同：样品中菌量低时，多管发酵或MPN法更适合；菌量较高、背景相对可控时，平板计数法更直观；快速检测或批量检测时，商品化测试片具有操作简便、读数效率高的优势。滤膜法则常用于饮用水、水源水等液体样品的检测。

一、大肠菌群与大肠埃希氏菌的区别

大肠菌群是一个功能性检验概念，不是单一菌种。它包括多种可在规定条件下发酵乳糖产酸产气的肠杆菌科相关细菌。大肠埃希氏菌是一个具体菌种，通常用 Escherichia coli 表示。多数大肠埃希氏菌能发酵乳糖并产生β-葡萄糖醛酸苷酶，但也存在例外，例如部分菌株酶活性弱或阴性。因此，培养基显色和产气结果通常用于筛选和计数，必要时仍需确证。

二、紫红胆盐乳糖琼脂平板计数法

紫红胆盐乳糖琼脂，即VRBA，是大肠菌群平板计数中常用的选择性鉴别培养基。其主要选择性来自胆盐和结晶紫，可抑制部分革兰氏阳性菌；乳糖和中性红用于显示乳糖发酵产酸反应。大肠菌群发酵乳糖后产酸，使菌落呈红色或紫红色，周围常可见胆盐沉淀环。

常规操作中，选择适宜稀释度的样品匀液，每个平板加入1 mL，再加入已熔化并冷却至约45℃的VRBA，轻轻旋转混匀。凝固后可再覆盖一层VRBA，以形成相对低氧环境并增强选择性。平板凝固后倒置培养，按相应标准规定的温度和时间进行培养。培养后选择菌落数适宜的平板计数典型菌落。

VRBA上的典型大肠菌群菌落通常为红色至紫红色，直径约0.5 mm或更大，菌落周围可见胆盐沉淀。若几个菌落生长过近，菌落可能变小或相互融合，影响计数。食品样品中若含有较多非乳糖碳水化合物、色素、酸性物质或大量背景菌，低稀释度平板可能出现颜色干扰、非典型菌落或假阳性结果。因此，对低稀释度平板或结果可疑样品，应按标准要求进行确证试验。

三、大肠菌群典型菌落的确认

VRBA平板上出现典型菌落，只能说明其符合大肠菌群的初筛特征，不能直接作为最终确认依据。对于需要确认的菌落，可挑取典型菌落转接至乳糖胆盐发酵管、煌绿乳糖胆盐肉汤或其他规定确证培养基，观察是否产酸产气。确认阳性后，再按计数规则换算样品中大肠菌群数量。

确认步骤的意义在于排除假阳性。某些非目标菌在VRBA上也可能形成类似颜色或沉淀反应；而部分目标菌在受损、培养条件偏差或样品基质干扰下，也可能表现为非典型菌落。因此，标准化的确认程序比单纯肉眼观察更可靠。

四、大肠埃希氏菌计数与酶底物法

大肠埃希氏菌计数常利用其典型生化特征进行检测，其中β-葡萄糖醛酸苷酶活性是重要指标之一。某些干燥复水膜或显色培养基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷，即X-Gluc，用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性。大肠埃希氏菌水解底物后可形成蓝色菌落；若体系同时含乳糖发酵产气指示结构，则蓝色菌落伴随气泡可作为典型结果。

原文中“检测葡萄糖醛酸的活性”表述不准确，更严谨的说法是检测β-葡萄糖醛酸苷酶活性。还需注意，酶底物法对大多数大肠埃希氏菌适用，但并非所有大肠埃希氏菌都表现为β-葡萄糖醛酸苷酶阳性。因此，涉及特殊菌株、争议样品或法规判定时，应按现行标准规定进行确认。

五、干燥复水膜和测试片法

干燥复水膜或测试片法是商品化快速计数方法之一。其基本原理是将脱水培养基、选择性成分、显色底物和凝胶体系预制在载体中，使用时加入样品液，使培养基复水并固定样品。培养后根据菌落颜色、气泡或其他指示特征进行计数。

这类方法的优点是操作简便、平板制备工作量小、读数直观，适合批量样品检测。但它仍属于微生物培养法的一种，结果可靠性依赖样品稀释、加样体积、培养条件、读数规则和产品性能。不同品牌测试片的判读规则可能不同，不能把某一产品说明直接套用于另一产品。若用于标准方法或质量控制，应确认其适用范围和性能验证要求。

六、滤膜法在水样检测中的应用

滤膜法常用于饮用水、水源水和其他液体样品中大肠菌群或大肠埃希氏菌检测。其基本流程是将一定体积水样通过无菌滤膜过滤，使微生物截留在滤膜表面，再将滤膜转移到选择性或显色培养基上培养。培养后根据典型菌落计数或进行确认。

滤膜法的优势是可检测较大体积样品，适用于目标菌含量较低的水样；缺点是样品浑浊、颗粒多或含抑菌物质时，容易堵膜或影响菌体恢复。对高浊度水样或含大量背景菌的样品，需选择合适过滤体积、稀释方式和培养基体系。

七、结果计算与报告

平板计数结果通常按样品稀释倍数和接种体积换算为CFU/g或CFU/mL。若采用MPN法，则根据阳性管数查表计算，结果以MPN/g或MPN/mL表示。测试片法和滤膜法也应按对应方法规则进行计数和报告。

报告结果时，应明确检测对象和方法。例如“大肠菌群计数：×× CFU/g”与“大肠埃希氏菌计数：×× CFU/g”不是同一个指标，不能混写。若仅完成初筛而未进行确证，应避免使用确定性表述。

八、常见问题与注意事项

VRBA平板颜色过深或背景发红，可能与样品中酸性物质、可发酵糖类、低稀释度基质干扰或培养基pH异常有关。此时应选择更合适稀释度，并对可疑菌落进行确认。

菌落过小或无典型沉淀环，可能是目标菌受损、培养时间不足、培养基选择性过强、倾注培养基温度过高或样品中存在抑菌物质。应检查阳性质控菌株和培养基批次性能。

平板菌落蔓延或难以计数，常见原因是样品接种量过高、平板表面水分过多、混匀不均或背景菌过多。可提高稀释度，控制平板干燥状态，并选择菌落数适宜的平板计数。

测试片出现气泡干扰时，应区分发酵产气和加样操作带入的气泡。加样时应避免产生机械气泡，培养后根据产品说明书规定的典型特征进行判读。

九、总结

大肠菌群和大肠埃希氏菌计数是食品和水质卫生评价中的重要检测项目。大肠菌群反映的是一类具有共同检验特征的指示菌群，大肠埃希氏菌则是具体菌种，二者不能混同。VRBA平板计数法适用于大肠菌群计数，酶底物显色体系和相应计数方法可用于大肠埃希氏菌检测，测试片和滤膜法则为不同样品类型提供了更便捷或更适合的检测选择。

实际操作中，应根据样品类型、污染水平、检测目的和现行标准选择方法。典型菌落只是筛选依据，确证试验、质控菌株和规范报告同样重要。只有明确检测对象、控制培养基质量、规范计数和确认程序，才能保证大肠菌群和大肠埃希氏菌检测结果准确可靠。