单增李斯特菌初筛：从染色镜检到糖发酵初步判断

单核细胞增生李斯特氏菌，常简称单增李斯特菌，拉丁名为 Listeria monocytogenes，是食品微生物检验中重点关注的食源性致病菌之一。该菌可在低温环境中生长，对冷藏食品、即食食品、乳制品、肉制品和水产制品的安全控制具有重要意义。选择性平板上出现可疑菌落后，若直接对所有菌落进行完整鉴定，工作量较大；若只挑选少数典型菌落，又可能漏检。因此，在高污染样品中增加初筛步骤，有助于提高检验效率和结果可靠性。

截至2026年6月，GB 4789.30-2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》已经发布并实施，该标准代替GB 4789.30-2016，规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验、平板计数和MPN计数方法。标准信息显示，GB 4789.30-2025于2025年3月16日发布，2025年9月16日实施。 因此，企业知识库文章在介绍旧资料时，应把“初筛”定位为选择性分离后的辅助判断环节，而不是最终确认步骤。

一、初筛的目的：减少漏检，也减少无效鉴定

单增李斯特菌选择性平板上可能出现多个典型或疑似菌落，尤其是肉制品、乳制品、即食食品和环境样品中背景菌较复杂时，可疑菌落数量较多。初筛的目的，是先利用形态、染色、运动性和少量生化反应排除明显不符合特征的菌落，再把高度可疑菌株转入后续确认鉴定。

初筛不能替代标准确认。木糖阴性、鼠李糖阳性、革兰阳性短杆菌和翻滚样运动等特征，只能说明菌株符合单增李斯特菌的典型筛查特征；最终结果仍需依据现行标准规定的确认方法，包括溶血、CAMP试验、生化鉴定、PCR或质谱等确认手段。

二、染色镜检：革兰阳性短杆菌是重要线索

从选择性平板挑取可疑菌落，经纯化后可进行革兰氏染色和湿片检查。单增李斯特菌通常为革兰氏阳性、无芽孢、短小杆菌，菌体大小约为0.4～0.5 μm × 0.5～2.0 μm。新鲜培养物中常呈短杆状或球杆状，排列可单个、成对或短链状。

需要注意的是，老龄培养物可能出现细胞延长、染色不均或革兰染色变浅，甚至表现为革兰可变，这并不代表其真正变为革兰阴性菌。因此，染色镜检最好使用新鲜纯培养物，避免因培养时间过长造成误判。

湿片检查时，可用无菌生理盐水制备菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察运动性。单增李斯特菌在20～25℃培养时可形成周生鞭毛，常表现为轻微旋转、翻滚样运动；在37℃培养时鞭毛表达明显减少，运动性减弱甚至不明显。因此，观察运动性时应注意培养温度和菌龄，否则可能出现假阴性判断。

三、糖发酵初筛：木糖阴性、鼠李糖阳性

原资料建议在高污染样品中增加木糖和鼠李糖发酵初筛，这一思路有实际意义。单增李斯特菌通常表现为木糖阴性、鼠李糖阳性。若使用含指示剂的糖发酵管，木糖阴性一般保持原色或不产酸，鼠李糖阳性则因产酸出现颜色变化。原文中“木糖阴性为蓝色，鼠李糖阳性为黄色”的描述，取决于所用发酵管的基础配方和pH指示剂，不能脱离具体产品说明书机械套用。

糖发酵初筛的推荐逻辑如下：

四、TSA-YE纯化：不是显色判断，而是获得纯培养

从选择性平板上应分别挑取多个典型或可疑菌落进行初筛。原资料建议挑取5个以上典型或可疑菌落，这一点适合高背景污染样品：挑取数量过少，容易漏掉目标菌；挑取数量过多，则增加后续确认工作量。实际检测应按现行标准要求和实验室内部SOP执行。

挑取可疑菌落后，一方面可接种木糖、鼠李糖发酵管进行初筛；另一方面应同步在胰酪大豆琼脂添加酵母浸膏培养基，即TSA-YE平板上划线纯化，获得单一纯培养物。TSA-YE主要作用是支持李斯特菌良好生长和纯化保存，不应理解为普通意义上的“显色培养基”。

原资料中提到“TSA-YE平板上可疑菌落为淡蓝色”，表述需要修正。单增李斯特菌在TSA-YE上通常形成小而圆、灰白至半透明菌落，在特定斜射光或透射光条件下可呈蓝灰色、蓝绿色或珍珠样光泽。这种观察依赖光照角度、培养时间、培养基状态和菌落厚度，不能像显色培养基那样仅凭颜色作出结论。

五、初筛流程建议

选择性琼脂平板培养后，先观察典型和可疑菌落。对高污染样品，应优先挑取不同形态、不同区域的可疑菌落，避免只挑取最典型菌落。每个可疑菌落分别进行编号，并同步进行糖发酵初筛和TSA-YE纯化。纯化后的菌株再进行革兰染色、湿片运动性观察和后续确认鉴定。

初筛结果较符合单增李斯特菌特征的菌株，应进入确认流程；结果明显不符的菌株可减少后续工作量，但不建议仅凭单项阴性结果直接排除，尤其是在菌落形态典型或样品风险较高时。木糖、鼠李糖、运动性、染色结果需要组合判断。

六、常见误判与控制要点

单增李斯特菌初筛最常见的误判来自三类因素。第一是培养物不纯。若从选择性平板挑取菌落时带入杂菌，糖发酵和镜检结果可能混乱，因此同步划线纯化很关键。第二是菌龄和培养温度不合适。老龄培养物可出现革兰染色变浅，37℃培养物运动性可能不明显，均可能造成误判。第三是把初筛反应当作最终确认。木糖阴性、鼠李糖阳性虽然典型，但并非单增李斯特菌独有，必须结合标准确认方法。

质量控制方面，应设置已知阳性和阴性对照菌株，用于验证糖发酵管、TSA-YE培养基、染色液和显微观察条件是否正常。糖发酵管应关注基础颜色、灭菌后pH、产酸变色范围和培养后是否出现非特异性变色。TSA-YE平板应关注营养支持能力、表面干湿度和菌落可分离性。平板过湿时菌落边界不清，过干时菌落生长受限，都会影响后续挑取和判断。

七、与新版标准的衔接

GB 4789.30-2025的标准摘要显示，其第一法适用于食品中单增李斯特菌定性检验，第二法适用于含量较高食品的计数，第三法适用于含量较低食品的计数。 与旧版资料相比，新版标准对培养基、检验程序和鉴定方法均有调整，行业解读也提到新版增加选择性培养基并修改了增菌液、检验程序和鉴定方法等内容。 因此，企业在建立内部文件时，应以现行标准文本为准，把本文所述初筛作为提高效率的辅助环节，而不是脱离标准单独报告结果。

小结

单增李斯特菌初筛的核心是“先筛后确证”。从选择性平板挑取多个典型或可疑菌落后，可通过TSA-YE纯化、革兰染色、湿片运动性观察以及木糖、鼠李糖发酵反应进行初步判断。典型单增李斯特菌通常表现为革兰阳性短杆菌、无芽孢、低温培养后有翻滚样运动、木糖阴性、鼠李糖阳性。TSA-YE上的蓝灰色或蓝绿色光泽可作为辅助观察，但不能作为显色培养基结果判读。最终报告仍应依据GB 4789.30-2025等现行标准规定的确认方法完成。