细胞支原体污染的影响：细胞培养中“看不见”的干扰源

在细胞培养实验中，细菌、真菌污染通常较容易发现，因为培养液会变浑浊、变色，显微镜下也常能看到明显杂菌。但支原体污染不同，它往往没有明显浑浊，也不一定立刻造成细胞大量死亡，却能持续改变细胞状态、代谢活动、基因表达和实验结果，是细胞培养中最隐蔽、也最容易被低估的污染类型之一。ATCC 将支原体污染列为细胞培养和生物制品生产中的重要风险，并强调应通过常规检测及时识别污染细胞和试剂。

一、什么是支原体？

支原体（Mycoplasma）是一类无细胞壁的原核微生物，属于柔膜体类细菌。它们结构简单，细胞内没有真核细胞那样的膜性细胞器，主要可见结构为核糖体。由于缺乏细胞壁，支原体形态可变，对渗透压较敏感，并天然不敏感于青霉素、头孢菌素等主要作用于细胞壁合成的抗生素。

原文中“支原体又称人形支原体”的说法不准确。人型支原体（Mycoplasma hominis）只是支原体中的一个种，不能用来代指全部支原体。细胞培养污染中常见的支原体还包括口腔支原体、精氨酸支原体、发酵支原体等，不同实验室和细胞来源中的污染种类可能不同。

支原体体积很小，常规光学显微镜下难以直接识别，且许多支原体污染不会使培养基明显浑浊。污染细胞在短期内可能仍能传代、贴壁和增殖，这也是支原体污染容易长期潜伏的主要原因。Thermo Fisher 的细胞培养资料也指出，支原体污染的表现通常较隐蔽，可表现为细胞增殖速度下降、饱和密度降低或悬浮细胞凝集，但也可能在不造成明显细胞死亡的情况下长期存在。

二、支原体污染从哪里来？

细胞培养中的支原体污染来源较多，常见包括操作者携带的口腔或呼吸道微生物、污染的细胞株、血清或培养基添加物、实验器材、培养箱和生物安全柜环境，以及不同细胞系之间的交叉污染。支原体可通过气溶胶、飞溅液滴、移液器、共用试剂瓶和不规范操作传播，因此一个污染细胞系往往会影响同一实验室中的多条细胞线。

其中最危险的来源是已经污染但未被发现的细胞株。如果将污染细胞与其他细胞共用培养箱、水浴锅、试剂或操作台，支原体可在实验室内持续传播。支原体污染的预防重点不是“发现细胞变差后再处理”，而是建立细胞复苏、传代、冻存和实验前的常规检测制度。相关综述建议，通过良好无菌操作、保持实验室清洁、减少操作事故、及时丢弃阳性培养物等方式预防污染。

三、对细胞生长和形态的影响

支原体会与培养细胞竞争营养物质，消耗培养液中的氨基酸、核苷、糖类和其他小分子代谢底物，使细胞生长变慢、状态变差，严重时可导致细胞增殖停滞、贴壁能力下降、细胞变圆、空泡化、脱落甚至死亡。污染早期，细胞可能只是“长得慢”“状态不稳定”“传代后恢复差”，并不一定出现典型细菌污染的浑浊现象。

显微镜下有时可见细胞间散在小黑点，但仅凭小黑点不能确诊支原体污染，因为培养基沉淀、细胞碎片、血清颗粒和死亡细胞残片也可能产生类似表现。较可靠的判断仍应依赖 PCR、荧光染色、培养法或专用支原体检测试剂盒。

支原体污染还可能影响细胞骨架、细胞膜完整性和细胞黏附状态，进而导致细胞形态异常。Thermo Fisher 资料指出，支原体污染可改变宿主细胞代谢和形态，并可能造成染色体损伤、细胞病变反应和实验数据不可靠。

四、对细胞代谢和分子水平的影响

支原体污染最严重的问题，是它会在细胞“看似还能生长”的情况下改变细胞内部代谢。部分支原体大量消耗精氨酸，导致培养体系中精氨酸水平下降，从而影响蛋白质合成、细胞分裂和细胞生长。代谢组学研究显示，支原体污染细胞中的精氨酸水平可显著降低，提示支原体会干扰细胞精氨酸代谢。

除氨基酸代谢外，支原体还可影响 DNA、RNA 和蛋白质合成，改变细胞膜抗原表达、染色体稳定性、能量代谢和信号转导。InvivoGen 综述指出，支原体可与宿主细胞竞争营养和生物合成前体，改变 DNA、RNA、蛋白质合成，降低氨基酸和 ATP 水平，并可能引起染色体改变和细胞膜抗原变化。

这类改变会直接影响细胞实验结果。例如，同一细胞系在支原体阴性和阳性状态下，细胞增殖曲线、药物敏感性、转染效率、病毒产量、细胞因子分泌、免疫标志物表达和基因表达谱都可能不同。因此，支原体污染不仅是“细胞状态不好”的问题，更是实验数据真实性和可重复性的问题。

五、对实验结果的具体干扰

支原体污染可影响几乎所有依赖活细胞状态的实验。对于药物筛选，它可能改变细胞增殖速度和代谢活性，使 IC₅₀、细胞毒性或抑制率发生偏差；对于分子生物学实验，它可能干扰 RNA 表达、蛋白表达和信号通路分析；对于免疫学实验，它可能改变细胞因子分泌和表面抗原表达；对于病毒学实验，它可能影响病毒复制、包装和滴度。Drexler 等综述指出，支原体污染能在被感染培养物中产生多种复杂影响，并且对细胞培养中常用的多种抗生素具有抵抗性。

六、为什么抗生素不能解决所有问题？

很多实验室习惯在培养基中加入青霉素-链霉素，但这并不能可靠预防支原体污染。原因很简单：支原体没有细胞壁，青霉素和头孢菌素这类作用于细胞壁合成的抗生素对其无效或效果很弱。即使某些抗支原体药物可用于清除污染，也可能对细胞产生额外压力，改变细胞状态，并且不能保证完全清除。Thermo Fisher 资料明确指出，由于支原体缺乏细胞壁，它们对常见靶向细胞壁的抗生素如青霉素具有抵抗性。

因此，对于普通实验细胞，最稳妥的处理原则通常是：发现支原体阳性后，优先丢弃污染细胞，重新复苏经过检测确认阴性的冻存细胞。只有当细胞极其珍贵、无法替代时，才考虑使用专用抗支原体试剂进行清除，并在处理后连续复检，确认阴性后再用于正式实验。

七、如何检测和预防支原体污染？

支原体污染不能靠肉眼和普通显微镜可靠判断，应建立定期检测制度。常用检测方法包括 PCR 法、DNA 荧光染色法、培养法和酶学或发光法检测试剂盒。PCR 法速度快、灵敏度高，适合日常筛查；培养法耗时较长，但在部分质量控制场景中仍有价值；DNA 染色法可观察细胞外支原体 DNA 荧光颗粒，但需要经验判断。

建议在以下节点进行支原体检测：新细胞株引入时、细胞复苏后、冻存前、关键实验前、长期传代过程中、细胞状态异常时，以及怀疑污染或与污染细胞共处同一培养环境后。ATCC 建议通过常规检测快速识别污染细胞和试剂，这是降低细胞培养与生物制品风险的重要措施。

预防方面，应做到细胞分区管理，避免不同来源细胞共用培养基和移液器吸头；不共用未经分装的血清和添加剂；培养箱、水浴锅和生物安全柜定期清洁；操作时减少气溶胶和飞溅；新引入细胞必须隔离培养并检测阴性后再进入常规细胞库。

结语

支原体污染的危险之处在于“隐蔽而持久”。它不一定让培养基变浑浊，也不一定马上杀死细胞，却能持续改变细胞增殖、代谢、形态、基因表达、蛋白表达、免疫反应和病毒产量。对于细胞培养实验而言，支原体污染不是小问题，而是足以推翻实验结论的系统性干扰因素。

因此，细胞培养质量控制的核心应从“发现异常再处理”转向“定期检测、源头隔离、污染即追踪”。只有保证细胞来源清楚、支原体检测阴性、传代过程规范，后续药物筛选、分子检测、免疫实验和细胞功能实验的数据才具有可靠性。