细菌的生理、生化试验简介：从代谢反应看懂细菌鉴定

细菌的生理、生化试验，是利用细菌对糖类、蛋白质、氨基酸、含硫化合物、含氮化合物等物质的代谢差异，对菌株进行鉴别的一类基础方法。很多细菌在显微镜下形态相似，仅靠菌落大小、颜色或革兰氏染色难以区分，此时就需要通过生化反应观察其“吃什么、分解什么、产生什么”，从而缩小鉴定范围。

生化试验广泛用于食品、药品、水质、临床和环境微生物检验。常见项目包括糖发酵试验、淀粉水解试验、V-P 试验、甲基红试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、尿素酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、三糖铁琼脂试验和 SIM 试验等。需要注意的是，生化结果必须来自纯培养物，并结合菌落形态、染色特征、培养条件和标准方法综合判断，不能用单一生化项目直接定名。

一、糖发酵试验：观察产酸和产气能力

不同细菌分解利用糖类、醇类和糖苷的能力不同。有的细菌能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等底物，产生酸或酸和气体；有的细菌则不能利用相应底物。糖发酵试验正是利用这种差异进行鉴别。

常用培养基中加入酚红、溴甲酚紫、溴百里酚蓝或 Andrade 指示剂。若细菌发酵糖产酸，培养基 pH 降低，指示剂颜色发生改变；若同时产气，倒置小管内可见气泡。半固体糖发酵管还可辅助观察气泡、弥散生长和动力表现。

操作时，用接种针或接种环挑取新鲜纯培养物接种于发酵管中，36 ℃±1 ℃培养，按规定时间观察颜色和产气情况。判读时应注意，有些菌株反应较慢，需要延长培养；有些培养基在长时间培养后可能因蛋白胨分解产碱而发生颜色回转，因此应在标准规定时间内判定。

二、淀粉水解试验：检测淀粉酶活性

部分细菌能产生淀粉酶，将淀粉水解为糊精、麦芽糖或葡萄糖。淀粉遇碘液呈蓝黑色，而被水解后的区域不再显蓝黑色，因此可通过加碘液观察透明圈判断结果。

常用方法是将 18 h～24 h 纯培养物接种于淀粉琼脂平板或斜面，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h，必要时低温菌可延长培养。培养后滴加碘液覆盖菌落周围区域。若菌落周围出现无色或浅色透明圈，而未被水解的培养基呈蓝黑色，为淀粉水解阳性；若菌落周围无透明圈，培养基整体呈蓝黑色，为阴性。

淀粉水解结果受菌株淀粉酶产生能力、培养时间、培养基淀粉含量和 pH 影响。培养基宜接近中性，平板不宜长期保存，避免淀粉老化或背景反应异常。

三、V-P 试验：检测乙酰甲基甲醇途径

V-P 试验用于检测细菌是否能经丁二醇发酵途径产生乙酰甲基甲醇，即 acetoin。Acetoin 在强碱和氧气存在下被氧化为二乙酰，二乙酰再与培养基中蛋白胨的胍基类成分反应，形成红色化合物，即 V-P 阳性。

常用 Barritt 法：将待试菌接种于葡萄糖蛋白胨水或 MR-VP 培养基，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h 或按标准要求培养后，取培养液加入 α-萘酚和氢氧化钾试剂，充分振摇，使氧气进入体系。出现红色为阳性；无红色或呈铜色、黄色为阴性。

V-P 试验常用于肠杆菌科细菌鉴别。例如，部分 Enterobacter、Klebsiella 常为 V-P 阳性，而典型 Escherichia coli 多为 V-P 阴性。但不同菌株和试剂系统可能有差异，不能只凭 V-P 单项判定菌种。

四、甲基红试验：检测混合酸发酵

甲基红试验用于判断细菌发酵葡萄糖后是否产生大量稳定酸性产物。若细菌通过混合酸发酵途径产生乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸等，使培养基 pH 降至 4.4 以下，加入甲基红指示剂后呈红色，为阳性。

操作时，将纯培养物接种于 MR-VP 培养基，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h 或按标准要求培养，取培养液加入甲基红指示剂。红色为阳性，黄色为阴性，橙色通常为可疑或弱反应，应结合培养时间和标准要求复核。

原文中“pH 5.0 以下随酸度增强黄色”的说法不正确。甲基红在强酸性条件下呈红色，在 pH 约 6.2 以上呈黄色，中间区域可呈橙色。因此，MR 阳性应判为红色，而不是黄色。

五、靛基质试验：检测色氨酸分解能力

靛基质试验用于检测细菌是否具有色氨酸酶，能将培养基中的色氨酸分解生成靛基质。靛基质与 Kovacs 试剂中的对二甲氨基苯甲醛反应，可形成红色化合物。

常用方法是将纯培养物接种于蛋白胨水或含色氨酸培养基，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 后，加入 Kovacs 试剂数滴，轻轻混匀或静置观察。若表面出现红色环，为靛基质阳性；若为黄色或无红色变化，为阴性。

靛基质试验常用于大肠埃希氏菌、变形杆菌、克雷伯菌、肠杆菌等肠杆菌科细菌鉴别。需要注意，培养基必须含足量色氨酸，普通营养肉汤不一定适合直接用于该试验。

六、硝酸盐还原试验：无红色不能直接判阴性

硝酸盐还原试验用于检测细菌是否能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，或进一步还原为氮气、氨等产物。常用试剂为磺胺酸和 α-萘胺或其替代试剂。若培养后加入试剂出现红色，说明产生亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性。

关键点是：**加入 A、B 试剂后不变红，不能直接判为阴性。**因为硝酸盐可能未被还原，也可能已被进一步还原为氮气或氨，体系中已经没有亚硝酸盐。此时应加入少量锌粉复判：若加锌粉后变红，说明原硝酸盐仍存在，细菌未还原硝酸盐，为阴性；若加锌粉后仍不变红，说明硝酸盐已被细菌进一步还原，为阳性。

硝酸盐还原试验必须设置未接种培养基对照和已知阳性、阴性对照。部分传统试剂成分具有毒性或潜在危害，操作时应按实验室安全要求使用。

七、明胶液化试验：检测蛋白水解能力

明胶液化试验用于检测细菌是否产生明胶酶。明胶被水解后失去凝胶性质，即使低温冷却也不能重新凝固。

常用方法是将新鲜纯培养物穿刺接种于明胶高层培养基，20 ℃～22 ℃培养数天至两周。若在较高温度培养，明胶本身可能因温度升高而融化，因此观察前应将试管置于冰箱冷却。冷却后仍呈液态，为明胶液化阳性；冷却后重新凝固，为阴性。

明胶平板法也可用于快速观察。培养后在菌落周围加入相应显色或沉淀试剂，若菌落周围出现透明圈或清晰水解带，为阳性。明胶液化常用于芽孢杆菌、假单胞菌、变形杆菌等细菌鉴别。

八、尿素酶试验：检测尿素分解产氨

尿素酶试验用于检测细菌是否能产生尿素酶，将尿素分解为氨和二氧化碳。氨使培养基变碱，酚红指示剂由黄色或橙黄色变为粉红色或玫红色。

操作时，可将纯培养物大量接种于尿素培养基或尿素琼脂斜面，36 ℃±1 ℃培养，并按规定时间观察。快速强阳性菌如奇异变形杆菌可在短时间内使培养基变红；弱阳性菌可能需要较长时间。若培养基无粉红色变化，通常判为阴性，但最终判读时间应按试剂说明或标准方法执行。

尿素培养基中的尿素不耐高温，一般需要过滤除菌后无菌加入已灭菌并冷却的基础培养基中，避免高温分解造成假反应。

九、氧化酶试验：鉴别呼吸链细胞色素氧化酶

氧化酶试验用于检测细菌是否具有细胞色素 c 氧化酶。氧化酶阳性菌可将试剂中的还原型显色底物氧化，产生紫色、蓝紫色或深蓝色反应。

常用方法是用无菌木棒、塑料接种环或铂丝挑取新鲜菌落，涂于氧化酶试纸或滤纸试剂上，在规定时间内观察颜色变化。若短时间内出现紫色或蓝紫色，为阳性；无变化或超时后变色，不应作为阳性。

氧化酶试验常用于区分假单胞菌、弧菌、气单胞菌等氧化酶阳性菌与肠杆菌科氧化酶阴性菌。操作时不宜使用含铁接种针，以免引起假阳性；也不宜从含糖选择性培养基或过老菌落上直接取菌，避免结果不稳定。

十、硫化氢试验：观察黑色沉淀

某些细菌可分解含硫氨基酸或还原硫代硫酸盐，产生硫化氢。硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐反应，形成黑色硫化物沉淀。

常用培养基包括 TSI、KIA、SIM、含硫化合物和铁盐的鉴别培养基等。将纯培养物穿刺接种后，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 或按要求延长观察。培养基中出现黑色沉淀为 H₂S 阳性；无黑色为阴性。

也可采用醋酸铅纸条法，将待试菌接种于液体培养基中，悬挂醋酸铅纸条于管口上方，不接触液面。培养后纸条变黑，为阳性。由于醋酸铅具有毒性，现代实验室应尽量使用更安全和规范的替代方法。

十一、三糖铁琼脂试验：一次观察糖发酵、产气和 H₂S

三糖铁琼脂（TSI）含葡萄糖、乳糖、蔗糖、蛋白胨、酚红、硫代硫酸盐和铁盐，可同时观察糖发酵、产气和硫化氢产生情况。操作时，用接种针挑取纯培养物，先穿刺底层，再划线斜面，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 后判读。

TSI 的典型结果包括：

TSI 判读时间很重要。若培养过久，斜面可能因蛋白胨分解产碱而变红，导致结果偏差。对肠杆菌科初筛，通常按 18 h～24 h 判读最可靠。

十二、SIM 试验：联合检测 H₂S、靛基质和动力

SIM 培养基可同时检测硫化氢产生、靛基质产生和运动性。用接种针挑取纯培养物，沿中心线穿刺接种约 1/2～2/3 深度，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 后观察。

培养基出现黑色沉淀，为 H₂S 阳性；细菌仅沿穿刺线生长，为动力阴性；若从穿刺线向外弥散生长，使培养基混浊，为动力阳性。观察完 H₂S 和动力后，向培养基表面加入 Kovacs 试剂，若表面出现红色环，为靛基质阳性。

SIM 常与 TSI、尿素、枸橼酸盐、MR-VP 等项目联合，用于肠杆菌科细菌初步鉴别。由于 H₂S 黑色沉淀可能遮盖动力观察，必要时应结合半固体动力培养基或其他试验复核。

十三、常见生化试验用途总结

结语

细菌生理、生化试验的核心，是通过代谢特征识别细菌。糖发酵反映碳源利用，MR 和 V-P 反映葡萄糖分解途径，靛基质反映色氨酸分解，硝酸盐还原反映氮代谢，明胶液化和淀粉水解反映胞外酶活性，氧化酶反映呼吸链特征，TSI 和 SIM 则将多个反应整合到一个培养基中。

在实际检验中，生化试验应遵循三个原则：第一，必须使用纯培养物；第二，必须按规定温度和时间判读；第三，必须将多个试验组合分析，而不是依赖单项结果。只有这样，生化鉴定才能真正发挥其在微生物分类、食品检验、药品检验和培养基质控中的作用。