食品中蜡样芽胞杆菌检验：样品处理、MYP平板计数与结果判定

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一类常见的食源性致病菌，广泛存在于土壤、尘埃、谷物、香辛料、乳制品、肉制品、米饭、面制品和调理食品中。它能形成芽胞，对干燥和热处理具有一定耐受性；若熟制食品冷却不及时、常温放置时间过长，芽胞可萌发并增殖，进而造成食品安全风险。B. cereus 可引起两类胃肠道疾病：呕吐型和腹泻型，其中呕吐型与食品中预先形成的耐热毒素 cereulide 有关，腹泻型则多与摄入菌体后在肠道内产生肠毒素有关。

我国食品中蜡样芽胞杆菌检验主要依据 GB 4789.14-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》。该标准代替 GB/T 4789.14-2003，规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法，其中第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高食品的计数，第二法适用于含量较低食品的 MPN 计数。

一、样品处理：先保证代表性和活菌状态

冷冻样品应在受控条件下解冻，可在 45℃以下不超过 15 min，或在 2℃～8℃条件下不超过 18 h 解冻。解冻的目的不是加热处理样品，而是使样品恢复到可均质状态，避免局部温度过高造成菌体损伤或污染水平改变。若不能及时检验，应按标准要求低温保存，避免目标菌继续增殖或死亡导致结果偏差。

非冷冻且易腐败样品应尽可能及时检验。若不能立即检测，应置于 2℃～8℃冷藏，并在规定时间内完成检验。对于米饭、湿米粉、乳制品、肉制品、调理食品等高风险样品，样品采集、运输和保存过程要避免反复升温和长时间常温放置，否则检测结果可能无法真实反映原样品污染水平。

二、样品制备：制成 1:10 样品匀液

以无菌操作称取样品 25 g 或量取 25 mL，加入 225 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）或标准规定的稀释液中，制成 1:10 样品匀液。固体或半固体样品可使用旋转刀片式均质器以 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或使用拍击式均质器拍击 2 min。若无均质器，可将样品在无菌乳钵中充分研磨后，再加入稀释液充分振荡混匀。

样品制备的关键是“均匀”。蜡样芽胞杆菌在食品中可能分布不均，尤其是粉状原料、米面制品、含颗粒配料食品和复合调理食品。如果均质不充分，后续平板计数或 MPN 结果会出现较大波动。

三、方法选择：直接平板计数与 MPN 计数

GB 4789.14-2014 包含两类思路：直接平板计数法和MPN 计数法。直接平板计数法适用于污染水平较高、预期能在选择性平板上形成可计数菌落的样品；MPN 法适用于污染水平较低、竞争菌较多或需要提高检出机会的样品。FDA BAM 也采用 MYP 或 Bacara 平板进行 B. cereus 计数，并规定选择 15～150 个典型菌落的平板进行计数和确证。

需要注意：**增菌后的培养物不能直接用于定量平板计数结果报告。**增菌会改变菌量比例，适合检出或 MPN 推断，不适合当作原样品直接计数依据。若要报告 CFU/g 或 CFU/mL，应使用原样品匀液及其系列稀释液直接涂布平板，并按确证比例折算。

四、系列稀释：为获得可计数平板做准备

吸取 1:10 样品匀液 1 mL，加入 9 mL PBS 或规定稀释液中，充分混匀，制成 1:100 样品匀液。随后根据样品污染情况，继续进行 10 倍系列稀释。每递增稀释一次，应更换 1 支无菌吸管或无菌吸头，避免高浓度样品带入低浓度稀释管造成误差。

对于污染水平不明的样品，建议选择 2～3 个连续稀释度进行接种，以提高获得可计数平板的概率。液体样品可根据预期污染水平选择原液或适当稀释液接种。

五、MYP 平板计数：典型菌落只是“可疑阳性”

选择 2～3 个适宜连续稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液，分别涂布于 MYP 琼脂平板，每个稀释度做两个平板。涂布时用无菌 L 棒均匀涂布整个平板表面，避免触及平板边缘。若 MYP 平板表面有水珠，应在使用前适当干燥，待表面水珠消失后再接种。

接种后，将平板倒置，于 30℃±1℃培养 24 h±2 h。若菌落不典型或反应不清晰，可继续培养 18 h～24 h 后再观察。MYP 平板上蜡样芽胞杆菌典型菌落通常表现为粉红色或灰白至微粉红色，周围有白色或淡粉红色沉淀环。这一特征来自两个反应：B. cereus 通常不发酵甘露醇，因此菌落及周围培养基保持粉红色；同时多数菌株卵磷脂酶阳性，可分解卵黄中的卵磷脂，形成不透明沉淀环。FDA BAM 明确指出，B. cereus 在 MYP 上通常表现为卵磷脂酶阳性、甘露醇阴性，典型菌落必须进一步经生化试验确认。

六、典型菌落挑取与纯培养

计数后，应从每个平板挑取至少 5 个已计数的典型或可疑菌落进行确证；若某平板上典型或可疑菌落少于 5 个，则应全部挑取。将可疑菌落分别划线接种于营养琼脂平板，30℃±1℃培养 24 h±2 h，获得纯培养物后再进行确证试验。

营养琼脂上，典型蜡样芽胞杆菌菌落多为灰白色，偶见黄绿色，不透明，表面粗糙，呈毛玻璃状、融蜡状或粗糙扩展状，边缘常不规则，直径可达数毫米。但菌落形态受培养基、菌株、培养时间和水分条件影响较大，因此只能作为辅助判断。

七、确证试验：避免把蜡样芽胞杆菌群误判为 B. cereus

蜡样芽胞杆菌属于 B. cereus group，相关近缘菌包括 B. thuringiensis、B. mycoides、B. anthracis 等。它们在部分培养特征和生化反应上相似，因此不能只凭 MYP 平板菌落直接报告为蜡样芽胞杆菌。

确证通常包括革兰氏染色、芽胞观察、MYP 反应、葡萄糖厌氧产酸、硝酸盐还原、V-P 试验、酪氨酸分解、溶菌酶耐受、动力和溶血等项目。FDA BAM 对 B. cereus 的确认特征包括：大型革兰氏阳性杆菌，芽胞不膨大；MYP 上卵磷脂酶阳性且不发酵甘露醇；可厌氧利用葡萄糖产酸；多数可还原硝酸盐；V-P 阳性；可分解酪氨酸；可在 0.001% 溶菌酶存在下生长。

八、结果计算：按确证比例折算

平板计数时，应选择具有 15～150 个典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板进行计数。由于 MYP 上可疑菌落并不一定全部为 B. cereus，必须根据确证结果按比例折算。

计算逻辑为：

每 g 或每 mL 样品中蜡样芽胞杆菌数 = 平板平均可疑菌落数 × 确证阳性比例 × 稀释倍数 × 10

其中乘以 10，是因为每块平板接种量为 0.1 mL，相当于将结果换算到 1 mL 接种体积。FDA BAM 也采用类似逻辑，按确证阳性比例折算 B. cereus 细胞数，并说明由于接种量为 0.1 mL，最终稀释倍数需再乘以 10。

例如：某样品 10⁻⁴ 稀释度两个平板平均可疑菌落数为 65 个，挑取 5 个可疑菌落确证，其中 4 个为蜡样芽胞杆菌，则结果为：

65 × 4/5 × 10⁴ × 10 = 5.2 × 10⁶ CFU/g 或 CFU/mL

报告时应使用科学计数法，并注明检测方法和单位。若全部平板低于可计数范围、超过可计数范围或无典型菌落，应按标准要求报告为小于检出限、估计值或未检出，不能随意取单一平板结果。

九、低含量样品：可采用 MPN 思路提高检出机会

对于预期蜡样芽胞杆菌含量较低的样品，可采用 MPN 方法。其基本思路是将样品不同稀释度接种于胰酪胨大豆多粘菌素肉汤等选择性增菌体系中，于 30℃左右培养后，取阳性管划线接种 MYP 平板，再挑取典型菌落进行确证，最后根据阳性管数组合查 MPN 表计算结果。FDA BAM 也建议 MPN 法用于预计 B. cereus 数量较低、竞争菌较多或干制食品中芽胞可能需要额外营养萌发的情况。

MPN 法的优点是灵敏度较高，适合低污染样品；缺点是耗时较长，统计置信区间较宽，结果精密度不如直接平板计数。实验室应根据样品类型、检测目的和标准要求选择方法。

十、常用培养基和试剂作用

十一、操作注意事项

第一，样品处理要迅速、低温、均匀，避免检测前目标菌增殖或死亡。第二，MYP 平板表面不能过湿，否则菌液扩散会影响菌落分离和计数。第三，计数应选择 15～150 个典型或可疑菌落的平板，过多或过少都会降低准确性。第四，可疑菌落必须经纯培养和确证，不能仅凭粉红色菌落和沉淀环直接报告。第五，蜡样芽胞杆菌群近缘菌较多，若结果用于风险评估、溯源或中毒事件调查，应结合毒素检测、分子鉴定或其他确认方法。

食品安全控制上，蜡样芽胞杆菌的重点不是单纯“加热杀菌”，而是防止芽胞在熟制后萌发增殖。B. cereus 芽胞可在加热后存活，若食品在适宜温度下放置时间过长，芽胞可萌发为营养细胞并产生毒素。呕吐型毒素 cereulide 一旦在食品中形成，普通再加热难以可靠消除，因此米饭、米粉、面食、调理食品等熟制后应尽快冷却、冷藏或热保温。BCCDC 建议食品应保持 60℃以上热藏或 4℃以下冷藏，再加热时中心温度应达到足够水平。

结语

蜡样芽胞杆菌检验的核心流程可概括为：样品规范处理、制备 1:10 匀液、系列稀释、MYP 平板选择性分离与计数、挑取可疑菌落纯培养、确证试验、按确证比例折算并报告结果。对于低含量样品，可采用 MPN 法提高检出机会。

对于实验室而言，关键不只是会做平板，更要理解 MYP 的选择鉴别原理和结果计算逻辑。粉红色菌落加沉淀环只是可疑结果，确证阳性后才能纳入最终计数。对于食品企业而言，控制蜡样芽胞杆菌的重点在于原料卫生、熟制后快速冷却、低温储存、热链管理和防止交叉污染，尤其要避免米饭、淀粉类食品、调理食品在危险温度带长时间放置。