双歧杆菌的检验：样品处理、厌氧培养与结果判定

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类常见的益生菌，广泛用于发酵乳、益生菌粉、固体饮料、婴幼儿配方食品及其他含活菌产品中。与普通污染菌检测不同，双歧杆菌检验的目的通常不是查找致病菌，而是确认产品中是否含有目标菌属、活菌数量是否达到标示要求，以及菌种鉴定结果是否符合产品设计。GB 4789.34-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》规定了双歧杆菌的鉴定及计数方法，适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数，也适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种鉴定和仅含双歧杆菌属食品的计数。

原流程图中使用“BBL琼脂平板、PGY液体培养基、TPY液体培养基”等旧式流程表达，其中 BBL 琼脂可理解为用于双歧杆菌分离计数的选择性或专用培养基。按现行 GB 4789.34-2016，检验时更规范的表述应为：样品经稀释后接种于双歧杆菌琼脂平板或 MRS 琼脂平板，36℃±1℃厌氧培养 48 h±2 h，必要时可延长至 72 h±2 h。

一、双歧杆菌的基本检验思路

双歧杆菌为革兰氏阳性、无芽孢、无动力、严格厌氧或偏厌氧生长的细菌，显微形态常呈短杆状、纤细杆状、球杆状，也可见分支或分叉等多形态。GB 4789.34-2016 将双歧杆菌典型形态描述为革兰氏染色阳性，可呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成分支或分叉，不抗酸、无芽孢、无动力，过氧化氢酶试验为阴性。

检验流程可概括为：样品制备 → 系列稀释 → 厌氧培养 → 菌落计数 → 挑取典型菌落 → 革兰氏染色和过氧化氢酶试验 → 生化鉴定或仪器鉴定 → 必要时进行有机酸代谢产物检测 → 报告结果。对于只需要计数的样品，重点是获得可计数平板并按 CFU/g 或 CFU/mL 报告；对于需要菌种鉴定的样品，还需进一步结合生化反应、质谱、分子方法或标准规定的补充试验确认。

二、样品处理：制备 1:10 样品匀液

食品样品通常取 25.0 g 或 25.0 mL，加入 225.0 mL 灭菌生理盐水，充分均质后制成 1:10 样品匀液。GB 4789.34-2016 规定，样品可置于装有 225.0 mL 生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋中，经 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或用拍击式均质器拍打 1 min～2 min。冷冻样品可在 2℃～5℃条件下解冻不超过 18 h，也可在不超过 45℃条件下解冻不超过 15 min。

样品处理阶段的关键是减少氧暴露和机械损伤。双歧杆菌对氧较敏感，样品打开、称量、均质和稀释时间不宜过长；冻干菌粉、益生菌固体饮料等样品还应注意充分溶散，避免菌粉结团导致计数偏低。对于高活菌样品，应提前预估菌量，选择合适稀释范围，避免平板菌落过密而无法计数。

三、系列稀释与培养：厌氧条件是关键

样品匀液制备后，用无菌吸管或移液器进行 10 倍系列稀释。每递增稀释一次，应更换无菌吸管或吸头，防止高浓度样品带入低浓度稀释管。根据样品标示活菌量或预期菌量，选择 2～3 个适宜稀释度进行接种。

现行标准计数方法采用倾注平板法：每个稀释度吸取 1.0 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿；再加入 15 mL～20 mL 冷却至 46℃的双歧杆菌琼脂培养基或 MRS 琼脂培养基，混匀凝固后倒置，36℃±1℃厌氧培养 48 h±2 h，必要时可延长至 72 h±2 h。标准还要求从样品稀释到平板倾注应在 15 min 内完成。

原图中“每个适当稀释度各以 0.1 mL 加入 BBL 琼脂平板进行表面涂布”的流程，属于旧式或特定产品方法中常见操作。若企业内部方法或产品标准规定使用表面涂布法，应进行方法适用性验证；若按 GB 4789.34-2016 出具标准检验结果，应优先采用标准规定的倾注平板流程。

四、菌落计数：不是所有菌落都可直接算作目标菌

培养后，记录平板上的菌落数量。GB 4789.34-2016 规定，菌落计数以 CFU 表示，宜选择 30 CFU～300 CFU、无蔓延菌落生长的平板进行计数；低于 30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计，每个稀释度应采用两个平板的平均数。

双歧杆菌在双歧杆菌琼脂或 MRS 平板上通常形成较小、圆形、乳白色至灰白色、不透明或半透明菌落，但菌落大小和形态会受菌种、培养基、厌氧环境、培养时间和样品基质影响。仅凭菌落外观不能完成菌种确认。若产品中可能混有乳酸杆菌、链球菌、嗜热链球菌或其他益生菌，普通 MRS 平板上的总菌落数不能直接等同于双歧杆菌数，应结合选择性培养基、菌落挑选和鉴定结果综合判断。

五、分离纯化与初步鉴定

从计数平板或分离平板上挑取典型单菌落，接种于双歧杆菌琼脂或 MRS 琼脂平板，36℃±1℃厌氧培养 48 h±2 h，必要时延长至 72 h±2 h，获得纯培养物。标准规定，食品样品鉴定时可挑取 3 个或以上的单个菌落进行纯培养。

纯培养后进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。双歧杆菌应表现为革兰氏阳性、不抗酸、无芽孢、无动力，过氧化氢酶阴性。若出现革兰氏阴性菌、芽孢杆菌、明显运动性菌株或过氧化氢酶阳性结果，应考虑污染菌或非目标菌，不能报告为双歧杆菌。

六、生化鉴定与有机酸检测

双歧杆菌不同种之间在糖类利用谱上存在差异，例如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、龙胆二糖、七叶灵等项目可用于辅助区分两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、青春双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌等。GB 4789.34-2016 列出了 33 项主要生化反应，并允许选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

有机酸代谢产物检测可作为可选项。双歧杆菌典型代谢特点是通过“双歧途径”产生乙酸和乳酸，标准附录 B 规定可测定培养液中乙酸和乳酸，若乙酸与乳酸含量比值大于 1，可判定为双歧杆菌的有机酸代谢产物。

原流程图中提到的 PGY 液体培养基可用于培养后测定乙酸、乳酸等代谢产物；TPY 液体培养基和“果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶”检测则是早期双歧杆菌鉴定中常见的补充思路。实际发布文章中建议将其写作“可作为补充鉴定方法”，而不是替代现行标准中的形态、生化和计数要求。

七、常用培养基及作用

八、结果报告与注意事项

计数结果应按 CFU/g 或 CFU/mL 报告。GB 4789.34-2016 规定，称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告；菌落数小于 100 CFU 时按整数报告，大于或等于 100 CFU 时可按两位有效数字或 10 的指数形式报告。

对于菌种鉴定结果，应根据涂片镜检、生化鉴定和必要的有机酸代谢产物检测综合报告。若只完成属水平计数，不应擅自报告到种名；若食品中含有乳酸杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等复合益生菌，应特别说明所用培养基和方法对双歧杆菌的选择性限制，避免把“乳酸菌总数”误写为“双歧杆菌数”。

操作中还应注意三点：第一，厌氧系统必须提前确认有效，厌氧指示剂应正常变色；第二，培养基温度不应过高，倾注平板时高温会损伤双歧杆菌；第三，样品从稀释到接种应尽快完成，长时间暴露空气可能导致活菌数偏低。

结语

双歧杆菌检验的核心，是在尽量减少氧损伤的条件下完成样品稀释、厌氧培养、菌落计数和纯培养鉴定。原流程图展示了早期双歧杆菌检验的基本框架：样品稀释后接种专用琼脂平板，厌氧培养，进行菌落计数、革兰氏染色、过氧化氢酶试验、生化反应及代谢产物检测。按现行 GB 4789.34-2016，应将培养基名称、接种方式和结果报告方式规范为“双歧杆菌琼脂或 MRS 琼脂、倾注平板计数、CFU/g 或 CFU/mL 报告”。

对于实验室和生产企业而言，双歧杆菌检测不能只追求“有菌落生长”。真正可靠的结果需要同时满足：厌氧培养条件合格、可计数平板范围合适、菌落经纯化确认、形态和过氧化氢酶结果符合双歧杆菌特征，必要时再通过生化或仪器方法完成种水平鉴定。