李斯特菌的鉴定和验证：从选择性平板到确证试验

李斯特菌属（Listeria）是一类革兰氏阳性短杆菌，其中食品安全中最重要的是单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。该菌可污染冷藏即食食品、乳制品、肉制品、水产品、果蔬和食品加工环境，并能在冷藏条件下存活甚至缓慢生长，因此其分离、鉴定和验证是食品微生物检验中的重点项目。

原文中的“李斯特菌鉴定和验证”主要来自传统培养鉴定流程，包括 Oxford 琼脂、PALCAM 琼脂、TSYEA 纯化、运动性、革兰氏染色、触酶/氧化酶、糖发酵、硝酸盐还原和 CAMP 试验等。需要修正的是：现行标准已发生更新。GB 4789.30-2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》已发布，并代替 GB 4789.30-2016，实施日期为 2025 年 9 月 16 日；该标准相较旧版增加了选择性培养基，并修改了增菌液、检验程序和鉴定方法。

一、选择性平板上的典型菌落

李斯特菌属通常能水解七叶苷。七叶苷水解产物与培养基中的铁盐反应，可形成黑褐色或黑色晕圈，这是 Oxford 琼脂和 PALCAM 琼脂上李斯特菌可疑菌落的重要特征之一。

在 Oxford 琼脂上，李斯特菌可形成较小、灰绿色至灰褐色菌落，周围常见黑色或黑褐色晕圈，培养时间延长后菌落中心可出现轻微下陷。原文中“菌落直径 2～3 mm”可作为传统描述，但实际大小会受菌株、培养时间、接种量和培养基状态影响，不能机械作为唯一判据。

在 PALCAM 琼脂上，可疑李斯特菌菌落通常呈灰绿色、绿色或橄榄绿色，周围带黑色晕圈或菌落中心发黑。PALCAM 中的甘露醇和指示剂体系可帮助区分部分伴生菌：多数单核细胞增生李斯特氏菌不发酵甘露醇，而部分干扰菌可因发酵甘露醇导致培养基颜色改变。

需要注意：Oxford 和 PALCAM 上的黑色晕圈只能说明“可疑李斯特菌或七叶苷水解阳性菌”，不能直接报告为单核细胞增生李斯特氏菌。食品样品中还可能存在肠球菌、某些芽胞杆菌或其他能形成类似反应的细菌，必须进行后续纯化和确证。

二、纯化培养：先获得可靠单菌落

从选择性平板上挑取典型或可疑菌落，通常至少挑取 5 个，分别划线接种到 TSYEA，即胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂上，于 35℃或 37℃需氧培养 24 h～48 h，以获得纯培养物。纯化是鉴定流程中不能省略的一步，因为选择性平板上的单个可疑菌落仍可能夹杂伴生菌或受培养基选择压力影响而表现不典型。

TSYEA 上的李斯特菌菌落通常较小、圆形、半透明或灰白色，表面光滑。采用 Henry 斜射光观察时，典型菌落可呈蓝色、蓝绿色或蓝灰色光泽，表面有细小颗粒感，类似磨砂玻璃。这个现象可作为辅助识别，但不应单独作为确认依据。

从 TSYEA 平板上挑取单个纯菌落，可分别接种 TSYEB 肉汤和 TSYEA 斜面，在 25℃培养 18 h～24 h，用于运动性观察、革兰氏染色、触酶、氧化酶和后续生化鉴定。之所以常用 25℃培养，是因为李斯特菌在室温或 20℃～25℃更容易表达鞭毛和运动性；在 37℃时运动性可能减弱。

三、基础鉴定：形态、运动性和酶反应

李斯特菌为革兰氏阳性、无芽胞短杆菌，常呈单个、短链或 V 形排列。若涂片显示革兰氏阴性杆菌、芽胞杆菌或球菌，应优先考虑非目标菌或混合污染。

运动性是李斯特菌的重要鉴别特征之一。在 20℃～25℃肉汤培养物中，显微镜下可见典型“翻滚样”或“翻筋斗样”运动；在半固体动力培养基中可形成伞状或倒伞状生长。这里要避免误判：布朗运动不是细菌动力，培养液摇动后造成的被动移动也不是典型运动性。

触酶试验方面，李斯特菌通常为触酶阳性；氧化酶试验通常为阴性。原文中“用 TSYEB 斜面上的生长物进行过氧化氢酶和氧化酶试验”应修正为“用 TSYEA 斜面或平板上的新鲜培养物进行试验”，因为斜面是琼脂培养物，不应写作 TSYEB。操作时应避免从含血培养基上直接取菌做触酶试验，以免红细胞中的过氧化氢酶造成干扰。

四、糖发酵和生化鉴定

传统鉴定中，李斯特菌可进行 D-葡萄糖、D-水杨苷、L-鼠李糖、D-木糖、甘露醇等糖发酵或利用试验。单核细胞增生李斯特氏菌通常发酵葡萄糖、鼠李糖、水杨苷，通常不发酵木糖和甘露醇。原文中“除格氏李斯特菌外，其他李斯特菌均不能分解甘露醇产酸”的表述不宜作为绝对判据；更稳妥的写法是：多数用于食品检验鉴别的 Listeria monocytogenes 不发酵甘露醇，甘露醇反应主要用于与部分干扰菌或其他李斯特菌种辅助区分。

常见鉴别项目可整理如下：

硝酸盐还原试验可作为辅助鉴别项目，但不能单独决定鉴定结果。若采用商品化生化鉴定条、全自动微生物鉴定系统、MALDI-TOF MS 或 PCR 方法，应按试剂说明书和标准要求进行质控。

五、CAMP 试验：验证单增李斯特菌的重要项目

CAMP 试验用于观察李斯特菌与指示菌之间的协同溶血现象。传统方法通常使用金黄色葡萄球菌和马红球菌作为指示菌，在血琼脂平板上划线接种，待检菌垂直靠近但不接触指示菌线，35℃或 37℃培养 24 h 左右观察。

单核细胞增生李斯特氏菌通常与金黄色葡萄球菌形成箭头状或增强 β 溶血反应，而 Listeria ivanovii 常与马红球菌形成较强 CAMP 阳性反应。CAMP 试验对区分部分李斯特菌种具有实用价值，但判读需要使用新鲜菌株、合格血琼脂和标准阳性/阴性对照。

六、溶血试验：区分单增李斯特菌不能忽视

单核细胞增生李斯特氏菌在羊血琼脂上通常产生窄小的 β-溶血环，有时溶血较弱，需要借助斜射光或挑取菌落后观察。溶血试验对于区分 L. monocytogenes 与部分非致病李斯特菌种很重要。

但溶血弱并不等于阴性。培养基血源、血液比例、培养时间、菌株差异和观察角度都会影响结果。若疑似菌株其他特征符合 L. monocytogenes，但溶血不清，应通过 CAMP 试验、分子检测或鉴定系统复核。

七、鉴定流程建议

按传统流程和现行标准思路，可将李斯特菌鉴定与验证概括为以下步骤：

八、容易误判的几个问题

第一，Oxford 或 PALCAM 上出现黑色晕圈，不等于一定是单核细胞增生李斯特氏菌。七叶苷水解阳性菌不止李斯特菌，必须纯化和确证。

第二，运动性试验温度不宜随意提高。37℃时李斯特菌鞭毛表达减少，运动性可能不明显；25℃更适合观察翻滚样运动。

第三，CAMP 试验需要对照菌。没有金黄色葡萄球菌、马红球菌和标准阳性/阴性对照，弱反应很容易误判。

第四，糖发酵结果不能孤立使用。鼠李糖阳性、木糖阴性、甘露醇阴性是重要线索，但仍需结合溶血、CAMP、形态和系统鉴定。

第五，标准版本要更新。旧资料中的 LB1/LB2 增菌液、Oxford/PALCAM 组合和传统生化流程，在企业内部知识库中可以作为历史方法介绍，但正式检验应按现行 GB 4789.30-2025 或相关有效标准执行。GB 4789.30-2025 的适用范围包括食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验，以及含量较高或较低食品中的计数方法。

结语

李斯特菌的鉴定和验证不能停留在“选择性平板上有黑圈”。规范流程应包括选择性分离、TSYEA 纯化、Henry 斜射光观察、革兰氏染色、运动性、触酶/氧化酶、生化反应、溶血试验、CAMP 试验以及必要的系统鉴定。对于食品安全检验而言，真正需要确认的是单核细胞增生李斯特氏菌，而不是泛泛的“李斯特菌样菌落”。

随着 GB 4789.30-2025 的发布，实验室在编写方法文件、培训资料和产品知识库时，应及时更新标准名称、检验流程和培养基体系。传统的 Oxford、PALCAM、TSYEA、CAMP 等内容仍有教学和理解价值，但正式报告必须依据现行有效标准和实验室确认方法出具。