白色念珠菌在抑菌剂效力测定中的应用

抑菌剂效力测定，又称防腐效力试验或抗微生物效力检查，是用于评价制剂中抑菌剂体系能否在产品储存和使用过程中抑制微生物污染及繁殖的方法。白色念珠菌（Candida albicans）是该试验中常用的真菌代表菌之一，主要用于考察产品对酵母类真菌污染的控制能力。该试验不是临床药敏试验，也不是测定某一抑菌剂对白色念珠菌的最低抑菌浓度，而是评价“成品制剂整体配方”在规定时间内对人工接种微生物的抑制或杀灭能力。

一、为什么要进行抑菌剂效力测定

对于水溶液制剂、乳膏、凝胶、滴眼剂、滴鼻剂、口服液以及多剂量包装制剂，如果产品本身没有足够的抗菌活性，就可能在生产、贮存或反复开启使用过程中受到微生物污染。污染微生物一旦在制剂中增殖，可能导致产品变质、有效成分降解，甚至对使用者造成感染风险。

因此，制剂中常需加入适宜的抑菌剂。但抑菌剂并不是加得越多越好。多数抑菌剂对人体细胞也具有一定刺激性或毒性，添加量应控制在“最低有效量”范围内。抑菌剂还可能受 pH、包装材料、表面活性剂、蛋白质、油相成分和贮存时间影响，导致有效浓度下降。因此，抑菌剂效力测定的核心目的，是确认最终产品在整个效期内仍具有足够的微生物控制能力。

二、白色念珠菌在试验中的作用

白色念珠菌是常见酵母样真菌，能代表制剂中可能出现的酵母污染风险。与细菌相比，酵母菌的细胞结构、生长速度和对抑菌剂的敏感性不同，因此不能用细菌试验结果替代真菌评价。一个抑菌体系即使能有效控制大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌，也未必对白色念珠菌和霉菌具有足够抑制能力。

在药品抑菌剂效力检查中，白色念珠菌通常与黑曲霉共同作为真菌代表。白色念珠菌主要反映酵母类污染控制能力，黑曲霉则反映霉菌孢子及丝状真菌污染控制能力。两者均合格，才能说明制剂对真菌污染具有较完整的防腐保护。

三、常用菌株与培养基

试验用菌株应采用规定来源的标准菌株或经确认的等效菌株，并应控制传代次数，避免长期传代导致生理状态改变。白色念珠菌常用标准菌株为 Candida albicans ATCC 10231，国内也常见 CMCC(F) 98001。

原文中连续列出两项“胰酪胨大豆肉汤培养基”，应理解为培养基项目重复或漏写琼脂培养基。对白色念珠菌而言，沙氏葡萄糖类培养基更常用于培养和计数；胰酪胨大豆类培养基更多用于细菌挑战菌或方法适用性相关环节。

四、试验基本流程

抑菌剂效力测定通常采用人工接种挑战法。先制备白色念珠菌的新鲜培养物，再用适宜稀释液制成一定浓度的菌悬液。随后将菌悬液接种到供试品中，使供试品达到规定的初始污染水平。接种量应尽量小，避免明显稀释供试品或改变其抑菌剂浓度、pH 和渗透压。

接种后的供试品在规定温度下保存，并在规定时间点取样计数。常见取样时间包括接种后初始时间、7 天、14 天和 28 天等。对白色念珠菌而言，重点观察其在供试品中是否被抑制、是否下降，以及后期是否重新增长。最终结果应根据产品类别对应的判定标准进行评价，而不能只看某一个时间点的菌落数。

试验应分别接种不同挑战菌，不建议把白色念珠菌与细菌、黑曲霉等混合接种。混合接种会造成不同微生物之间相互竞争，影响回收计数和结果解释。

五、方法适用性：防止“假阴性”的关键

抑菌剂效力测定最容易出现的问题，是样品中的抑菌剂在平板计数阶段继续发挥作用，导致菌落数偏低，看起来像“抑菌效果很好”，实际却是回收方法没有把抑菌剂中和掉。因此，正式试验前必须进行方法适用性确认。

方法适用性重点验证两件事：第一，所用稀释、中和、过滤或洗脱方法能有效解除样品的抑菌作用；第二，白色念珠菌在该回收体系中能够被稳定检出。常用解决方法包括增加稀释倍数、加入中和剂、采用薄膜过滤法、延长冲洗过程或调整培养基体系。若方法适用性不合格，正式抑菌效力结果没有可靠性。

不同抑菌剂需要不同中和策略。例如，季铵盐类常可考虑卵磷脂和吐温 80，碘类或含氯类残留可考虑硫代硫酸钠，酚类、醇类或酯类防腐剂则需根据配方特点验证稀释和中和效果。中和剂不能凭经验直接套用，必须通过回收试验证明其有效且本身不抑制白色念珠菌生长。

六、结果判读要点

白色念珠菌的结果通常以接种后不同时间点的活菌数变化来表示，可换算为 log 值下降量或判断是否较初始菌数增加。若供试品对白色念珠菌具有足够抑制能力，随着保存时间延长，菌数应保持不增加，或按相应产品类别要求出现一定程度下降。若菌数明显上升，说明该制剂对酵母类真菌污染控制不足，抑菌体系需要重新评估。

结果判读时应注意，白色念珠菌生长较细菌慢，计数培养时间通常更长。平板上应选择适宜菌落数范围进行计数，并排除污染菌干扰。若供试品本身颜色深、黏度高、含油相或含大量表面活性剂，可能影响取样均匀性和菌体回收率，应在方法开发阶段重点优化。

七、研发阶段如何利用该试验优化抑菌剂

在制剂研发阶段，抑菌剂效力测定可用于筛选防腐剂种类和浓度。常见思路是设置不同抑菌剂、不同浓度、不同 pH、不同包装材料和不同贮存条件的对比样品，观察白色念珠菌及其他挑战菌在 7 天、14 天、28 天内的变化。

若对白色念珠菌控制不足，可能原因包括抑菌剂浓度偏低、pH 不在最佳抑菌范围、抑菌剂被表面活性剂或包装材料吸附、油水分配导致水相有效浓度不足，或配方中含有促进真菌存活的营养成分。此时不应简单提高抑菌剂用量，而应综合调整 pH、防腐剂组合、螯合剂、溶剂体系、包装形式和生产卫生控制。

八、常见误区

第一，不能把抑菌剂效力测定等同于无菌检查。抑菌剂效力合格，只说明产品能控制一定水平的微生物污染，不代表产品无菌。

第二，不能用白色念珠菌单一菌株结果代表全部微生物风险。抑菌体系应同时覆盖细菌、酵母和霉菌等代表微生物。

第三，不能忽略方法适用性。若抑菌剂未被有效中和，计数结果会偏低，可能造成防腐体系合格的假象。

第四，不能用高浓度抑菌剂替代生产过程控制。抑菌剂不能弥补原辅料污染、设备清洁不足或包装环境失控。

第五，不能只在研发初期做一次试验。抑菌剂效力可能随贮存时间下降，成品放行、稳定性考察和效期末验证都应关注防腐体系是否仍然有效。

九、小结

白色念珠菌抑菌剂效力测定，是评价制剂防腐体系对酵母类真菌污染控制能力的重要环节。试验的关键不在于观察白色念珠菌能否被某种抑菌剂“杀死”，而在于确认成品配方在规定贮存条件和规定时间内能否持续抑制其增殖。可靠的检测应包括标准菌株、适宜培养基、合格的菌悬液制备、经验证的中和回收方法、规定时间点计数和按产品类别进行结果判定。对于多剂量、水性或易污染制剂，抑菌剂效力测定是保证产品微生物安全性和处方合理性的关键试验之一。