白色念珠菌菌种、菌液制备及培养基适用性检查要点

白色念珠菌（Candida albicans）是抑菌效力检查中常用的真菌代表菌，主要用于评价药品、化妆品或其他含水制剂对酵母类污染的控制能力。与普通微生物限度检查不同，抑菌效力检查属于人工接种挑战试验，需要将规定数量的试验菌接入供试品中，在一定贮存时间后检测存活菌数变化，从而判断产品防腐体系是否有效。试验结果是否可靠，取决于三个关键环节：菌种状态是否合格、菌液浓度是否准确、培养基和计数方法是否经过适用性确认。

一、试验菌种的选择与复苏

白色念珠菌试验应使用规定来源的标准菌株或经确认的等效菌株，常用菌株为 Candida albicans ATCC 10231 或相应国家菌种保藏编号菌株。菌株应来源清楚、代次可控、特征稳定，不宜使用长期反复传代、污染风险不明或生长状态异常的菌株。

菌种复苏后，应先在适宜培养基上培养，确认菌落形态、纯度和生长状态。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂上通常形成乳白色至奶油色、圆形、湿润、光滑的酵母样菌落。若出现杂菌、霉菌污染、菌落形态明显异常或生长过弱，应重新复苏或更换菌种，不应直接用于抑菌效力检查。

二、菌液制备的基本要求

白色念珠菌菌液应由新鲜、纯净、活性良好的培养物制备。通常挑取新鲜培养物，用适宜无菌稀释液制成菌悬液，经混匀后调整至规定浓度。稀释液应不影响白色念珠菌活性，也不应含有抑菌成分；常用稀释液包括 pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他经验证适用的稀释液。

菌液浓度不能只凭肉眼浊度估算，正式使用前应通过平板计数确认。抑菌效力检查对初始接种菌量有明确要求，若菌液浓度偏低，挑战强度不足，可能高估产品抑菌能力；若菌液浓度过高，则可能超过防腐体系承受范围，造成不合理失败。因此，菌液制备后应尽快使用，避免长时间放置导致菌数变化。

三、培养基适用性检查的意义

培养基适用性检查的目的，是确认所用培养基能够支持白色念珠菌正常生长，并能在规定条件下准确回收试验菌。对白色念珠菌而言，沙氏葡萄糖琼脂或其他适用真菌计数培养基常用于存活菌数测定；沙氏葡萄糖肉汤可用于菌种培养或菌液制备。若培养基促生长能力不足，最终计数偏低，会直接影响抑菌效力判定。

培养基适用性检查通常应关注三个方面：第一，培养基本身无菌；第二，白色念珠菌在该培养基上能稳定生长并形成可计数菌落；第三，培养条件、培养时间和计数范围符合方法要求。对于新批号培养基、不同厂家培养基或配方调整后的培养基，应进行适用性确认，不应仅凭配方名称判断其可用性。

四、供试品接种：优先使用原包装容器

抑菌剂效力可能受到容器材质、形状、装量、封口方式和内表面吸附作用影响。某些抑菌剂可能被塑料、橡胶塞或包装材料吸附，也可能因容器空间、混匀方式或pH变化而影响有效性。因此，只要供试品原包装容器的装量足够、便于无菌接种、混匀和取样，原则上宜将试验菌液直接接种至供试品原包装容器中进行贮存和检测。

若供试品因装量过小、黏度过高、包装结构不便操作或其他原因必须转移至无菌容器，应选择不会改变供试品性质的容器。容器材质不得吸附抑菌剂或活性成分，不得影响供试品 pH，也不得与制剂发生相容性问题。容器口径应便于样品转移、菌液接入、充分混匀和后续取样。

五、接种份数与接种量控制

供试品通常应按规定数量取样，分别接种不同试验菌。白色念珠菌应单独接种于一个供试品容器或一份供试品中，不应与细菌或黑曲霉等其他试验菌混合接种。若试验菌株数量增加，应相应增加供试品份数，避免不同微生物之间竞争生长或相互抑制，影响结果判断。

接种菌量应根据现行标准和产品类别控制。原文中提到“1、2、3类供试品 1 g 或 1 mL 接种菌量为 10⁵～10⁶ CFU，4类供试品为 10⁶～10⁸ CFU”，这类表述不宜脱离标准版本单独使用。实际检测时，应按《中国药典》或适用标准规定的产品类别、初始接种量和判定标准执行。

接种菌液体积应尽量小，一般不应明显改变供试品组成。原文提出接种菌液体积不超过供试品体积的 0.5%～1%，这一原则是合理的：接种体积过大会稀释抑菌剂、改变 pH 和渗透压，从而影响试验真实性。接种后应充分混匀，使白色念珠菌在供试品中均匀分布，避免取样结果波动过大。

六、接种后贮存条件

接种后的供试品应在规定温度下避光贮存，常见条件为 20～25 ℃。贮存期间应尽量减少温度波动，并防止二次污染。供试品容器应保持密闭或按标准规定方式封存，不应频繁开启。每次取样时应严格执行无菌操作，避免外源微生物进入供试品，导致存活菌数测定失真。

对于含光敏性成分、挥发性成分或易吸附防腐剂的产品，还应关注贮存容器、光照、密封性和取样频次对抑菌剂有效性的影响。试验设计应尽量模拟产品实际贮存和使用状态，但不能偏离标准规定的试验条件。

七、存活菌数测定与中和验证

由于供试品中含有抑菌剂或本身具有抗菌活性，存活菌数测定前必须验证计数方法是否适用。若样品中的抑菌剂在平板计数阶段仍继续发挥作用，白色念珠菌可能无法正常形成菌落，导致计数偏低，形成“抑菌效果合格”的假象。因此，方法适用性检查必须证明所采用的稀释、中和、薄膜过滤或冲洗方法能够有效解除供试品的抑菌作用。

常见中和方法包括增加稀释倍数、使用含卵磷脂和吐温 80 的中和液、采用薄膜过滤法并充分冲洗，或根据抑菌剂类型加入适宜中和剂。中和剂本身也必须经过验证，确认其不会抑制白色念珠菌生长。只有在回收率符合要求的前提下，后续存活菌数测定结果才具有判定意义。

存活菌数测定后，应根据计数结果计算每 1 mL 或每 1 g 供试品中白色念珠菌的菌数，并换算为 lg 值。再将不同时间点的菌数与初始菌数比较，判断菌数下降、维持或增长情况。对于菌落数过多、过少、平板污染或样品分布不均的结果，应按方法规定处理，必要时重新试验。

八、结果可靠性的常见影响因素

白色念珠菌抑菌效力相关试验中，常见问题包括菌液浓度不准、菌种活性不足、供试品混匀不充分、中和剂选择不当、培养基促生长能力不足、取样不均匀和计数培养时间不足。其中，中和不充分是最容易造成假性合格的因素；混匀不充分则容易造成平行样之间差异过大。

此外，供试品 pH 对抑菌剂活性影响很大。许多防腐剂只有在特定 pH 范围内才具有较强活性，例如有机酸类防腐剂受 pH 影响明显。若转移容器、稀释液或操作过程改变了供试品 pH，就可能改变试验结果。因此，必要时应监测供试品接种前后的 pH，并确认容器和操作过程不会影响产品性质。

九、小结

白色念珠菌菌种和菌液制备，是抑菌效力检查中评价酵母类真菌控制能力的基础。可靠的试验应使用来源明确、状态良好的标准菌株，制备浓度经计数确认的新鲜菌液，并通过培养基适用性和方法适用性检查，确认白色念珠菌能够被准确回收。供试品接种应优先在原包装容器中进行，接种体积应尽量小，接种后应充分混匀并在规定条件下贮存。最终通过各时间点存活菌数测定和 lg 值变化，评价产品防腐体系对白色念珠菌的抑制能力。