乳品中活性益生菌选择性检测方法研究概述

随着发酵乳、酸奶、乳酸菌饮料和益生菌乳制品的发展，嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌等常被用于乳品发酵或作为功能性菌株添加。消费者关注的不仅是产品中是否标注“含益生菌”，更关心产品在货架期内是否仍含有足够数量的活菌。因此，建立可靠的活性菌选择性计数方法，是乳品质量控制、产品研发和市场监督中的重要环节。

需要先明确一点：并非所有乳酸菌都等同于益生菌。益生菌强调“特定菌株、足够数量、对宿主健康有益”，其作用具有菌株特异性和剂量相关性。原文中“人体内部活性菌数量达到 97 CFU/g（mL）以上才有效”明显为排版或录入错误，通常应理解为 10⁷ CFU/g（mL）级别或更高数量级，但不同产品、菌株和功能声称对应的有效剂量并不完全相同，不能简单套用一个固定数值。

一、乳品活性菌检测的难点

乳品中的活性菌常以混合菌群形式存在。例如，传统酸奶中常含有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌；功能型酸奶或乳酸菌饮料中还可能加入嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌等。若只使用普通 MRS 琼脂或普通营养培养基计数，得到的往往是“总乳酸菌数”或混合菌落数，无法准确区分各菌种数量。

选择性检测的难点主要有三点。第一，多种乳酸菌营养需求相似，在同一培养基上均可生长。第二，不同菌株对氧气、pH、糖源、胆盐、抗生素和培养温度的耐受性不同，选择条件过强可能抑制目标菌。第三，乳品基质中含有蛋白、脂肪、糖类、稳定剂和酸性成分，可能影响稀释、分散和菌体恢复。因此，乳品中活性益生菌计数不能只看“能不能长”，更要看选择性、回收率和重复性。

二、供试菌种与样品类型

研究中常用的供试菌包括嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，ST）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus，LB）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）、双歧杆菌（Bifidobacterium spp.，BB）和干酪乳杆菌（现多归入 Lacticaseibacillus casei，LC）。

样品可分为两类：一类是已知菌样品，即分别将单一菌株接种于脱脂乳或适宜培养基中培养，用于验证培养基的促生长能力和选择性；另一类是市售乳品样品，如酸乳、发酵乳、乳酸菌饮料等，用于评价方法在真实样品中的适用性。前者用于建立和验证方法，后者用于观察方法能否应对复杂菌群和产品基质。

三、选择性培养基设计思路

乳品中不同活性菌的选择性计数，通常利用菌株之间在糖源利用能力、pH 耐受性、氧气需求、抗生素耐受性和生长温度方面的差异进行区分。

例如，将 MRS 琼脂中的葡萄糖替换为特定糖类或糖醇，可观察不同乳酸菌对碳源的利用差异。研究中曾比较水杨苷/柳苷类底物、纤维二糖、果糖、甘露醇、山梨醇等替代碳源，结果显示嗜酸乳杆菌对部分底物具有较好的利用能力，因此 MRS-水杨苷、MRS-山梨醇等培养基可用于嗜酸乳杆菌的选择性计数或与干酪乳杆菌的联合计数。不过，糖源选择性通常不是绝对的，不同菌株之间可能存在差异，必须通过标准菌株和样品验证后使用。

对于双歧杆菌，常采用含选择剂的 MRS 类培养基，例如 MRS-NNLP 琼脂，通过萘啶酸、新霉素、氯化锂、巴龙霉素等成分抑制部分非目标菌，并结合厌氧条件促进双歧杆菌生长。对于保加利亚乳杆菌，可利用其耐酸性，在 MRS-pH 5.2 琼脂上进行选择性计数。对于嗜热链球菌，可采用 ST 琼脂或 M17 琼脂。对于干酪乳杆菌，可采用 LC 琼脂等选择性培养基进行计数。

四、常见目标菌的选择性计数方案

在实际应用中，如果产品中同时含有嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，而某一培养基可同时计数 LA 和 LC，则可采用“总数计数 + 选择性计数”的差减思路。例如，用 MRS-山梨醇或 MRS-水杨苷类培养基测得 LA+LC 总数，再用 LC 琼脂测定干酪乳杆菌数量，两者差值可估算嗜酸乳杆菌数量。但这种方法只有在两种培养基的回收率、选择性和重复性均经验证时才可使用，否则差减结果可能放大误差。

五、市售乳品检测中的问题

对市售酸乳和乳酸菌饮料进行检测时，常可发现不同产品的活菌水平差异较大。有些产品在保质期内仍能保持较高的嗜酸乳杆菌、双歧杆菌或干酪乳杆菌数量；也有些产品虽然标称含有相关菌种，但检测到的活菌数较低。造成差异的原因可能包括初始添加量不足、菌株耐酸耐冷能力差、发酵后处理损伤、冷链控制不佳、货架期过长、氧气渗透、产品 pH 过低或防腐体系不适宜等。

因此，乳品活性益生菌检测不能只在生产当天进行，还应结合货架期稳定性考察。对于宣称含有特定益生菌的产品，企业应关注出厂时、流通过程中和保质期末的活菌数变化，确保产品标签、质量标准和实际检测结果一致。

六、方法建立时应关注的验证指标

选择性计数方法建立后，应至少验证促生长能力、选择性、专属性、回收率、重复性和适用样品范围。促生长能力用于确认目标菌能在培养基上形成可计数菌落；选择性用于确认非目标菌被有效抑制或形成可区分菌落；专属性用于确认目标菌菌落特征稳定；回收率用于评价该方法与非选择性培养基相比是否造成明显低估。

对于乳制品基质，还应验证样品稀释液、均质方式、pH、脂肪含量、蛋白凝块和稳定剂是否影响菌体分散及计数结果。若产品中存在高酸度、果粒、谷物、胶体增稠剂或其他功能成分，应分别确认方法适用性，不宜直接套用普通酸奶的检测条件。

七、常见误区

第一，不能用总乳酸菌数替代特定益生菌活菌数。总数高并不代表目标菌数量高。

第二，不能只根据培养基名称判断选择性。不同厂家、不同批次培养基的选择剂浓度、pH 和营养体系可能不同，必须用目标菌和干扰菌验证。

第三，不能忽略厌氧条件。双歧杆菌对氧敏感，培养环境不合适会导致计数偏低。

第四，不能把差减法作为无条件通用方法。差减法依赖两个计数体系的稳定性，任何一个体系偏差都会影响最终结果。

第五，不能仅检测出厂样。益生菌乳品的关键是保质期内仍有足够活菌，货架期末检测更能反映产品真实质量。

八、小结

乳品中活性益生菌选择性检测的核心，是在混合菌群中准确区分并计数目标菌。嗜热链球菌可采用 ST 琼脂或 M17 琼脂，保加利亚乳杆菌可采用 MRS-pH 5.2 琼脂，双歧杆菌可采用 MRS-NNLP 琼脂，干酪乳杆菌可采用 LC 琼脂，嗜酸乳杆菌可结合 MRS-水杨苷、MRS-山梨醇等培养基及差减法进行分析。实际检测中，应通过标准菌株、干扰菌和真实乳品样品验证培养基的促生长能力、选择性和回收率，避免仅凭单一培养基或总菌数判断产品中益生菌活性。只有建立经过验证的选择性计数体系，才能为益生菌乳制品质量控制、标签标识和货架期稳定性评价提供可靠依据。