除菌方法——过滤除菌的原理与应用

过滤除菌是微生物实验室和培养基生产中常用的除菌方法，主要适用于不宜加热灭菌的液体、溶液和部分气体。对于含糖溶液、维生素溶液、抗生素溶液、血清、酶制剂、部分生长因子和热敏性培养基添加剂，若采用高压蒸汽灭菌可能导致分解、失活、褐变或沉淀，此时可采用过滤除菌后，再以无菌操作加入已经灭菌并冷却的基础培养基中。

需要注意的是，过滤除菌的本质是“物理截留”，主要去除细菌、真菌孢子和悬浮颗粒，并不一定能去除病毒、噬菌体、支原体、内毒素或可溶性代谢产物。因此，在严格意义上，过滤除菌不同于高压蒸汽灭菌或干热灭菌，使用时应根据物料性质、污染风险和质量要求合理选择。

一、过滤除菌的基本原理

过滤除菌依靠滤膜孔径和膜结构对微生物进行截留。常用除菌滤膜孔径为 0.22 μm 或 0.2 μm 级，可有效截留多数细菌。滤膜材料常见有混合纤维素酯、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚偏二氟乙烯等，不同材料在蛋白吸附、耐溶剂性、流速、机械强度和化学兼容性方面存在差异。

膜过滤与深层过滤不同。深层过滤主要依靠滤材厚度、弯曲通道、吸附和机械截留共同作用；膜过滤则主要在膜表面和孔道处截留大于孔径或不能通过孔道的颗粒。用于除菌时，终端滤膜的孔径、完整性、材料兼容性和过滤过程的无菌控制，是影响结果的关键因素。

二、0.22 μm 与 0.45 μm 滤膜的区别

在微生物实验中，0.45 μm 和 0.22 μm 滤膜都很常见，但用途不同。0.45 μm 滤膜常用于水样微生物计数、样品预处理、颗粒去除和部分真菌或细菌检测。它适合截留较大颗粒和多数细菌细胞，但不宜作为常规除菌过滤的终端滤膜。

对于培养基添加液、糖溶液、维生素溶液、血清或抗生素溶液等需要除菌的物料，终端过滤通常应采用 0.22 μm 或 0.2 μm 级除菌滤膜。若溶液浑浊、黏度高或含蛋白较多，可先用较大孔径滤膜或玻璃纤维滤垫预过滤，再通过 0.22 μm 终端滤膜完成除菌。

三、适用范围：哪些物料适合过滤除菌

过滤除菌特别适用于热敏性、易降解或不宜高温处理的液体。例如，葡萄糖、乳糖、蔗糖等糖溶液在高温下可能发生焦糖化或美拉德反应；维生素、抗生素、酶、激素样成分和部分生长因子可能受热失活；血清和蛋白类成分高温处理后容易变性或沉淀。这类成分常采用过滤除菌后无菌加入。

在培养基生产中，常见做法是将基础培养基高压灭菌，冷却至适宜温度后，再加入过滤除菌的热敏添加剂，如抗生素、维生素、糖溶液、血清、卵黄乳液、显色底物或选择性添加剂。这样既能保证基础培养基无菌，又能减少热敏成分损伤。

过滤除菌也可用于气体除菌，如发酵用无菌空气过滤。空气过滤通常采用专用空气除菌滤器或疏水性滤膜，设计和验证要求高于普通液体过滤。需要强调的是，空气过滤对噬菌体和病毒等超小颗粒并非绝对可靠，发酵生产中还需结合管路灭菌、正压控制和完整性检测。

四、正压过滤与负压过滤

过滤方式可分为正压过滤和负压过滤。负压过滤常用于水样微生物检测和样品过滤，利用真空泵在滤膜下方形成负压，使液体通过滤膜。其优点是操作简单、适合检测用途；缺点是滤液接收系统容易受到真空管路、倒吸或密封不良影响，若用于制备无菌溶液，需要更严格的无菌控制。

正压过滤则通过注射器、压力罐、蠕动泵或压缩气体将液体推过滤膜。对于培养基添加剂、血清、糖溶液和抗生素溶液等小体积除菌，注射器式滤器非常常用。正压过滤的优点是装置紧凑、滤液可直接进入无菌接收容器，且可获得比负压更高、更稳定的过滤推动力。对于黏度较高或较难过滤的溶液，正压过滤通常更合适。

五、预过滤的作用

许多液体并不适合直接通过 0.22 μm 滤膜。若样品中含有较多颗粒、胶体、蛋白、细胞碎片或沉淀，终端滤膜很快会堵塞，导致过滤速度变慢、压力升高甚至滤膜破损。此时应先进行预过滤。

预过滤可使用玻璃纤维滤垫、较大孔径滤膜或深层滤材，先去除较大颗粒和悬浮杂质，再用 0.45 μm、0.65 μm 等中间孔径滤膜降低终端负荷，最后使用 0.22 μm 滤膜除菌。对于血清、蛋白溶液、酵母浸粉溶液、复杂培养基添加液等，逐级过滤通常比直接过滤更稳定。

若需要同时叠放多层滤膜，应注意滤膜之间的支撑和流速问题。部分装置可在滤膜之间加入惰性支撑网，以改善液流分布，但所有接触物料的部件都必须经过灭菌，并确认不会释放污染物或吸附关键成分。

六、滤膜材料选择

滤膜材料会影响过滤效率和产品质量。醋酸纤维素膜蛋白吸附相对较低，常用于水溶液和生物样品；聚醚砜膜流速较快、蛋白吸附较低，常用于培养基、缓冲液和血清类样品；尼龙膜机械强度好，但可能吸附部分蛋白或小分子；聚偏二氟乙烯膜耐化学性较好，适合部分有机溶剂或疏水性样品；疏水性 PTFE 膜常用于气体过滤和有机溶剂过滤。

选择滤膜时，不能只看孔径，还应关注化学兼容性、蛋白吸附、析出物、耐压能力、灭菌方式和样品回收率。对于昂贵或低浓度添加剂，如抗生素、维生素、细胞因子、酶或血清成分，滤膜吸附可能导致有效浓度下降，应通过回收率或性能试验确认。

七、过滤除菌操作要点

过滤前，应确认滤器、滤膜、接收容器和连接管路均已灭菌。一次性无菌针头滤器可直接使用，但应检查包装完整性和有效期。可重复使用滤膜架需与滤膜一起高压灭菌，或按说明书进行灭菌处理。过滤过程中应在洁净环境或生物安全柜、超净工作台内进行，避免滤后液体二次污染。

热敏溶液过滤前应尽量澄清，必要时先离心、沉降或预过滤。过滤时压力不宜过高，避免滤膜破裂或旁路泄漏。若过滤速度突然下降，不应强行加压，应更换滤膜或增加预过滤步骤。滤液应直接收集到无菌容器中，并尽快密封、标识和保存。

过滤后加入基础培养基时，应待基础培养基冷却到适宜温度，通常避免在过高温度下加入热敏成分。加入后应充分混匀，但避免产生大量气泡或造成污染。对成品培养基，还应进行无菌检查和适用性检查，确认过滤除菌和无菌加入过程可靠。

八、过滤除菌的局限性

过滤除菌不能去除所有微生物和微生物产物。部分支原体、病毒、噬菌体和超小细菌可能通过常规 0.22 μm 滤膜；内毒素、外毒素、代谢产物和可溶性酶也不能通过普通滤膜去除。因此，如果原料已经被毒素或病毒污染，过滤除菌不能保证其安全性。

此外，过滤除菌不适合高黏度、高颗粒、高脂肪或强吸附性液体。含油乳液、胶体体系、悬浮液或高蛋白高黏度溶液可能需要专门工艺。对于生产用途，除菌过滤还应进行工艺验证，包括滤膜完整性、过滤前后微生物负荷、滤膜兼容性、保持时间和无菌灌装控制。

九、常见错误

第一，用 0.45 μm 滤膜替代 0.22 μm 终端除菌滤膜。0.45 μm 可用于预过滤或检测，但不应作为常规除菌终端滤膜。

第二，忽略预过滤。复杂样品直接上 0.22 μm 滤膜，容易堵膜、升压和降低过滤稳定性。

第三，滤后液体暴露过久。过滤完成后若接收容器敞口放置，容易造成二次污染。

第四，滤膜材料随意选择。某些滤膜会吸附蛋白、抗生素或小分子活性物质，导致有效浓度下降。

第五，把过滤除菌等同于绝对灭菌。过滤主要截留细菌，不代表清除病毒、噬菌体、支原体或毒素。

十、小结

过滤除菌是一种适用于热敏液体和气体的物理除菌方法，常用于糖溶液、维生素溶液、抗生素溶液、血清、酶制剂和培养基添加剂的无菌处理。终端除菌通常应使用 0.22 μm 或 0.2 μm 级滤膜，0.45 μm 滤膜更多用于检测和预过滤。实际操作中，应根据样品性质选择合适滤膜材料和过滤方式，必要时采用逐级预过滤，并严格控制无菌操作、接收容器、滤膜完整性和滤后保存。只有正确理解过滤除菌的适用范围和局限，才能保证热敏成分既不被高温破坏，又能满足微生物控制要求。