蛋白质、氨基酸分解试验：原理、结果判断与应用

蛋白质和氨基酸分解试验是细菌生化鉴定中的重要内容。不同细菌具有不同的酶系统，可分解色氨酸、尿素、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、苯丙氨酸等底物，并产生吲哚、氨、胺类或有机酸等特征性产物。通过观察培养基颜色变化或加入显色试剂后的反应，可辅助鉴别肠杆菌科细菌、弧菌、变形杆菌、沙门氏菌、克雷伯菌等微生物。

这类试验的核心是“底物—酶—产物—指示剂反应”。因此，结果是否可靠，取决于培养基底物是否合格、菌株是否纯培养、培养时间是否适宜、对照是否成立以及显色试剂是否有效。

一、吲哚试验

吲哚试验用于检测细菌是否具有色氨酸酶。某些细菌能分解培养基中的色氨酸，生成吲哚、丙酮酸和氨。生成的吲哚可与 Kovac 试剂或 Ehrlich 试剂中的对二甲氨基苯甲醛反应，形成红色化合物。

常用培养基为蛋白胨水或含色氨酸的培养基。待检菌培养后，沿试管壁加入 Kovac 试剂，若液面上层出现红色环，即为吲哚阳性；若无红色变化或呈黄色，则为阴性。

吲哚试验常用于肠杆菌科细菌鉴别。例如，大肠埃希氏菌常为吲哚阳性，而多数肺炎克雷伯菌为阴性。需要注意，培养基中必须含有足够色氨酸，否则即使菌株具有色氨酸酶，也可能出现假阴性。

二、脲酶试验

脲酶试验用于检测细菌是否产生脲酶。脲酶可分解尿素，生成氨和二氧化碳，使培养基 pH 升高。培养基中常加入酚红作为 pH 指示剂：中性或微酸条件下呈橙黄色至黄色，碱性增强后变为粉红色或玫红色。

将待检菌接种于尿素培养基中培养后，若培养基变红或玫红色，说明尿素被分解、氨生成，判为脲酶阳性；若颜色不变或仍为黄色，则为阴性。

脲酶试验对变形杆菌属、克雷伯菌属、部分沙门氏菌和其他肠杆菌科细菌鉴别有参考价值。变形杆菌通常脲酶反应较强，可较快使培养基变红；某些弱阳性菌株则需要较长培养时间。尿素受热易分解，因此含尿素培养基通常不宜与尿素一起高压灭菌，应按配方要求过滤除菌后加入冷却的基础培养基。

三、氨基酸脱羧酶试验

氨基酸脱羧酶试验用于检测细菌是否能产生特定氨基酸脱羧酶。某些细菌在酸性和相对厌氧环境下，可使氨基酸脱去羧基，生成相应胺类物质，使培养基由酸性重新转为碱性。常见底物包括赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。

赖氨酸脱羧后可生成尸胺，鸟氨酸脱羧后可生成腐胺，精氨酸相关反应较复杂，常涉及精氨酸双水解酶系统或脱羧反应，最终使培养基碱化。试验培养基中通常含少量葡萄糖和 pH 指示剂。培养初期，细菌发酵葡萄糖产酸，使培养基变黄；若随后发生氨基酸脱羧或相关碱化反应，培养基又由黄色转为紫色或碱性颜色。

试验时应同时设置不含相应氨基酸的对照管，并用无菌液体石蜡或矿物油覆盖培养基表面，创造相对厌氧环境。若含氨基酸管由黄色转为紫色，而对照管保持黄色，判为阳性；若含氨基酸管和对照管均为黄色，判为阴性。若对照管未变黄，说明葡萄糖发酵阶段不成立，结果不宜判读。

四、苯丙氨酸脱氨酶试验

苯丙氨酸脱氨酶试验用于检测细菌是否能产生苯丙氨酸脱氨酶。该酶可使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸。苯丙酮酸与三氯化铁试剂反应后，可形成绿色化合物。

常用方法是将待检菌接种于苯丙氨酸琼脂斜面，培养后在菌苔表面滴加三氯化铁试剂。若斜面迅速出现绿色或深绿色，判为阳性；若不出现绿色或仅呈黄色、棕黄色，则为阴性。

苯丙氨酸脱氨酶试验常用于鉴别变形杆菌、普罗威登斯菌和摩根菌等。该类细菌多为阳性，而多数其他肠杆菌科细菌为阴性。判读时应在加入试剂后及时观察，因为绿色反应可能随时间变化而减弱或变色。

五、常见试验结果比较

六、影响结果的关键因素

蛋白质和氨基酸分解试验对培养条件较敏感。菌株必须为纯培养，否则混合菌群可能产生相互干扰。接种量过少会导致反应弱，接种量过大则可能造成非特异性变色。培养时间不足可能出现假阴性，培养时间过长又可能因碱性代谢产物积累造成误判。

培养基质量也很关键。吲哚试验培养基必须含色氨酸；尿素培养基中的尿素不能受热分解；氨基酸脱羧酶培养基应含有适量葡萄糖，并保持适宜初始 pH；苯丙氨酸琼脂中的底物和三氯化铁试剂应新鲜有效。对氨基酸脱羧酶试验而言，对照管尤为重要，没有对照管很难判断变紫是否来自特异性脱羧反应。

七、常见误区

第一，吲哚阳性不是“培养液整体变红”，而是加入 Kovac 试剂后上层形成红色环。

第二，脲酶阳性是碱化变红，不是产酸变色。若培养基变黄，不能判为脲酶阳性。

第三，氨基酸脱羧酶试验必须看对照管。含氨基酸管变紫、对照管变黄，才支持阳性。

第四，苯丙氨酸脱氨酶试验要及时观察。加三氯化铁后出现绿色才是典型阳性。

第五，单项生化试验不能直接确定菌种。应结合多个生化反应、培养特征和必要的确认方法综合判断。

八、小结

蛋白质和氨基酸分解试验通过检测细菌对特定底物的分解能力，反映其酶系统差异，是细菌生化鉴定的重要组成部分。吲哚试验检测色氨酸分解能力，脲酶试验检测尿素分解能力，氨基酸脱羧酶试验检测氨基酸脱羧或相关碱化反应，苯丙氨酸脱氨酶试验检测苯丙氨酸脱氨能力。实际应用中，应严格控制培养基、菌龄、接种量、培养时间、指示剂和对照设置，才能获得可靠结果。