生化鉴定试验——常用酶类试验原理与判读

酶类试验是细菌生化鉴定中最常用的一类方法。不同细菌具有不同的酶系统，可分解或转化特定底物，产生气泡、凝块、显色反应、透明圈或 pH 变化等结果。通过这些反应，可辅助判断细菌的属、种或某些重要生化特征。常见酶类试验包括触酶试验、氧化酶试验、靛酚氧化酶试验、凝固酶试验、DNA 酶试验和硝酸盐还原试验等。

酶类试验结果受菌龄、培养基成分、接种量、试剂新鲜度、培养条件和判读时间影响较大。实际鉴定时，应设置阳性和阴性对照，并结合培养特征、革兰染色及其他生化反应综合判断。

一、触酶试验

触酶试验又称过氧化氢酶试验，用于检测细菌是否产生过氧化氢酶。具有过氧化氢酶的细菌能将过氧化氢分解为水和氧气，释放出的氧气形成气泡。

操作时，可取新鲜菌落置于洁净玻片上，滴加 3% 过氧化氢溶液；也可将过氧化氢加入菌悬液中观察。若立即出现明显气泡，判为触酶阳性；若无气泡或仅有极少迟缓气泡，则为阴性。

触酶试验常用于区分葡萄球菌和链球菌。葡萄球菌多为触酶阳性，链球菌和肠球菌多为触酶阴性。需要注意，红细胞内含有过氧化氢酶，若直接取血琼脂平板上的菌落，可能因带入血液成分出现假阳性。因此，触酶试验宜选用不含血液的培养基上的新鲜菌落。

二、氧化酶试验

氧化酶试验用于检测细菌是否具有细胞色素 c 氧化酶。该酶属于细胞色素呼吸链系统成分，能使氧化酶试剂中的还原型指示剂被氧化，生成有色化合物。

常用试剂为四甲基对苯二胺或二甲基对苯二胺类试剂。将菌苔涂抹于洁净滤纸或氧化酶试纸上，滴加试剂后观察颜色变化。若在规定时间内迅速出现紫红色或深紫色，判为氧化酶阳性；若不变色或延迟变色，则按方法要求判为阴性或可疑。

氧化酶试验常用于鉴别肠杆菌科与非发酵菌。多数肠杆菌科细菌氧化酶阴性，而假单胞菌、弧菌、气单胞菌、奈瑟菌等多为氧化酶阳性。试验时不宜使用金属接种环，含铁材料可能催化试剂氧化造成假阳性；也不宜使用含高糖培养基上的菌落，因为酸性代谢环境可能影响酶活性和结果判读。

三、靛酚氧化酶试验

靛酚氧化酶试验也是检测细胞色素氧化酶活性的一种方法。其原理是：具有氧化酶的细菌可使细胞色素 c 氧化，氧化型细胞色素 c 进一步使盐酸对二甲氨基苯胺氧化，并与 α-萘酚结合，生成靛酚蓝，呈蓝色反应。

常用方法是使用靛酚氧化酶试纸条。将试纸条用无菌生理盐水湿润后，蘸取新鲜菌苔，立即观察颜色变化。若试纸条在规定时间内迅速变蓝，判为阳性；若无明显蓝色变化，则为阴性。

该试验与常规氧化酶试验原理相近，但所用显色体系不同。无论采用哪种方法，均应注意试剂有效期、试纸保存条件和判读时间。氧化酶类试剂极易被空气氧化，若空白试纸已变色，不应继续使用。

四、凝固酶试验

凝固酶试验主要用于鉴别金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可产生两类凝固酶：一种是结合凝固酶，位于菌体表面，可使血浆中的纤维蛋白原在菌体表面形成纤维蛋白样物质，引起凝集；另一种是游离凝固酶，分泌到培养环境中，可与血浆中凝固酶反应因子作用，使血浆凝固。

凝固酶试验常分为玻片法和试管法。玻片法主要检测结合凝固酶。将待检菌分别与兔血浆和生理盐水混合，若血浆侧出现明显颗粒状凝集，而生理盐水侧无自凝现象，判为阳性。若盐水侧也出现凝集，则提示菌株自凝，玻片法结果不可靠。

试管法主要检测游离凝固酶。将待检菌接种于稀释兔血浆中，在适宜温度下培养后观察是否凝固。若血浆形成凝块或凝胶状，不随试管倾斜流动，判为阳性；若仍为液体状态，则为阴性。试管法特异性通常优于玻片法，是确认凝固酶阳性葡萄球菌的重要方法之一。

五、DNA 酶试验

DNA 酶试验用于检测细菌是否产生细胞外脱氧核糖核酸酶。DNA 酶可水解培养基中的 DNA 长链，生成较短的寡核苷酸或单核苷酸。检测方式可分为盐酸沉淀法和指示剂显色法。

在盐酸沉淀法中，将待检菌点种于 DNA 琼脂平板，培养后加入盐酸。未被水解的长链 DNA 可被酸沉淀，使培养基呈浑浊；若菌落周围 DNA 被水解，则该区域不形成酸沉淀，出现透明圈。菌落周围有透明环者为 DNA 酶阳性，无透明环者为阴性。

DNA 酶试验常用于辅助鉴别金黄色葡萄球菌、沙雷菌和部分变形杆菌等。需要注意，DNA 酶阳性并非金黄色葡萄球菌所独有，因此不能单独作为确证依据，应与凝固酶试验、菌落特征和其他鉴定结果结合。

六、硝酸盐还原试验

硝酸盐还原试验用于检测细菌是否能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，或进一步还原为氨、氮气等更低价氮化合物。该试验常用于肠杆菌科、非发酵菌和厌氧菌等的鉴别。

试验中，将待检菌接种于硝酸盐培养基，培养后加入甲液和乙液。甲液通常含对氨基苯磺酸，乙液通常含 α-萘胺，在酸性条件下，若培养基中存在亚硝酸盐，可形成红色偶氮化合物。因此，加入试剂后立即变红，判为硝酸盐还原阳性，说明硝酸盐已被还原为亚硝酸盐。

若加入甲液、乙液后不变红，不能立即判为阴性，因为硝酸盐可能已被进一步还原为氨或氮气等。此时需加入少量锌粉。锌粉可将未被细菌还原的硝酸盐化学还原为亚硝酸盐。若加锌粉后变红，说明原培养基中仍有硝酸盐，细菌未还原硝酸盐，判为阴性；若加锌粉后仍不变红，说明硝酸盐已被细菌还原并进一步分解，仍判为阳性。

硝酸盐还原试验判读较容易出错，关键是理解“加锌后变红为阴性，加锌后仍不红为阳性”。

七、常用酶类试验结果汇总

八、结果可靠性的关键控制点

酶类试验应优先使用新鲜纯培养物。老化菌株可能酶活性下降，导致假阴性；混合菌则可能产生相互干扰。培养基也会影响结果，例如血琼脂可干扰触酶试验，含糖培养基可能影响氧化酶表现，DNA 琼脂的 DNA 含量不足会影响透明圈观察。

试剂新鲜度同样重要。氧化酶试剂易被空气氧化，应避光、低温保存，并按要求现配现用或在有效期内使用。过氧化氢长期放置可能分解，导致触酶试验反应减弱。硝酸盐还原试剂和锌粉也应保持有效，否则会造成判读错误。

所有关键试验均应设置阳性和阴性对照。若对照结果不符合预期，待检菌结果不宜判读。

九、常见误区

第一，触酶试验不能直接取血琼脂上的菌落，否则可能出现假阳性。

第二，氧化酶试验应在规定时间内判读，延迟变色通常不作为阳性。

第三，玻片凝固酶阳性不能完全替代试管凝固酶试验，尤其在结果可疑时应复核。

第四，DNA 酶阳性不是金黄色葡萄球菌的专属特征，只能作为辅助鉴别。

第五，硝酸盐还原试验加锌后的判读容易反向理解：加锌变红为阴性，加锌不变红为阳性。

十、小结

酶类试验通过检测细菌是否产生特定酶或是否具备某种代谢能力，为微生物鉴定提供重要依据。触酶、氧化酶、靛酚氧化酶、凝固酶、DNA 酶和硝酸盐还原试验均为常用项目。实际应用中，应严格控制菌龄、培养基、试剂、对照和判读时间，并将酶类试验结果与其他生化反应、培养特征和必要的确认方法综合分析，避免凭单一反应直接确定菌种。