MR-VP 试验：甲基红试验与 Voges-Proskauer 试验

MR-VP 试验是细菌生化鉴定中常用的一组糖代谢试验，包括甲基红试验（Methyl Red test，MR）和 Voges-Proskauer 试验（VP）。两者都以葡萄糖代谢为基础，但观察的是细菌分解葡萄糖后进入不同代谢途径所产生的终产物。MR 试验主要判断是否产生大量稳定酸性产物；VP 试验则检测是否产生乙酰甲基甲醇，即 acetoin。

MR-VP 试验常用于肠杆菌科细菌鉴别。例如，大肠埃希氏菌通常 MR 阳性、VP 阴性；产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌等常表现为 MR 阴性、VP 阳性。但不同菌株可能存在变异，实际鉴定应结合其他生化试验综合判断。

一、MR 试验的原理

甲基红试验用于检测细菌是否通过混合酸发酵途径分解葡萄糖。某些细菌能将葡萄糖分解为丙酮酸，再进一步生成乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸等多种稳定酸性产物，使培养基 pH 明显下降。当 pH 降至约 4.4 以下时，加入甲基红指示剂后呈红色，即为 MR 阳性。

另一些细菌虽然也能分解葡萄糖，但主要通过丁二醇发酵途径，酸性产物较少，培养后 pH 通常回升或维持在较高水平。当 pH 在 6.2 以上时，加入甲基红指示剂呈黄色，即为 MR 阴性。若呈橙色或橙红色，通常为可疑结果，需要延长培养或重复试验。

需要注意的是，原文中“甲基红变红范围为 pH 4.4～6.0”的表述不够准确。甲基红在酸性范围呈红色，在较高 pH 条件下呈黄色，约 pH 4.4 以下为红色，约 pH 6.2 以上为黄色，中间区域可呈橙色过渡。

二、MR 试验的方法与判读

MR 试验通常将待检菌接种于 MR-VP 培养基或葡萄糖蛋白胨水培养基中，在适宜温度下培养 24～48 h，必要时可适当延长。培养后取培养液加入甲基红试剂，轻轻混匀后立即观察颜色。

结果判断如下：培养液呈红色，为 MR 阳性；呈黄色，为 MR 阴性；呈橙色或红黄色之间的过渡色，应判为可疑，不宜直接作为最终结果。可疑结果常见于培养时间不足、菌量不合适、培养基缓冲能力异常或菌株代谢反应较弱时。

MR 阳性说明该菌能产生大量稳定酸，使培养基 pH 显著下降。MR 阴性则说明该菌不产生足量稳定酸，或酸性产物随后被进一步代谢，培养基 pH 未降至甲基红阳性范围。

三、VP 试验的原理

VP 试验用于检测细菌是否通过丁二醇发酵途径分解葡萄糖，并产生乙酰甲基甲醇，即 acetoin。acetoin 本身不直接呈红色，但在强碱性条件下可被空气中的氧氧化为二乙酰。二乙酰再与培养基中蛋白胨来源的胍基化合物，或试剂体系中的相关成分反应，形成红色化合物，即 VP 阳性。

常规 VP 试验常使用 Barritt 试剂：A 液为 α-萘酚，B 液为氢氧化钾或氢氧化钾-肌酸体系。α-萘酚可增强显色反应，氢氧化钾提供强碱性环境，并促进 acetoin 氧化。显色通常需要充分接触空气，因此加入试剂后应充分振荡或增加液面与空气接触，再按规定时间观察。

原文中将 VP 试剂写成“0.1%硫酸铜溶液”不适合作为常规 VP 试验表述。某些旧式或变法体系中可能使用铜盐作为辅助试剂，但标准化 VP 判读更常见的是 α-萘酚和氢氧化钾体系。

四、VP 试验的方法与判读

VP 试验通常与 MR 试验使用同一种基础培养液。培养完成后，取部分培养液加入 VP 试剂。常见做法是先加 α-萘酚试剂，再加氢氧化钾试剂，充分混匀，使培养液与空气接触，然后在室温或规定条件下放置一定时间观察。

若培养液上层或整体出现红色、玫红色，即为 VP 阳性；若无红色变化，仍呈铜色、黄色或浅棕色，则为阴性。VP 试验不能过早判读，因为显色需要氧化过程；但也不宜放置过久，否则可能出现非特异性变色。

VP 阳性说明细菌产生 acetoin，提示其偏向丁二醇发酵途径。VP 阴性则说明未产生可检测量 acetoin，或反应条件不足以显色。

五、MR 与 VP 的关系

MR 和 VP 试验反映的是葡萄糖代谢的不同方向。多数情况下，强 MR 阳性菌株常 VP 阴性；VP 阳性菌株常 MR 阴性。这是因为混合酸发酵会产生大量稳定酸，而丁二醇发酵则将部分酸性中间产物转化为较中性的 acetoin 和 2,3-丁二醇，使培养基酸度降低。

但这种关系不是绝对的。某些菌株可能出现弱反应、迟缓反应或非典型结果，因此 MR-VP 结果应与吲哚、枸橼酸盐利用、脲酶、运动性、糖发酵等其他项目综合分析。

六、常见菌株 MR-VP 表现

该表仅为常见反应模式，不能作为单独定种依据。不同菌株、培养基和方法条件可能导致结果差异。

七、培养基和质量控制要点

MR-VP 试验培养基通常含葡萄糖和蛋白胨，既提供发酵底物，又提供显色反应所需成分。培养基葡萄糖浓度、缓冲能力和蛋白胨质量都会影响结果。若葡萄糖不足，MR 和 VP 反应可能偏弱；若缓冲能力异常，pH 变化不典型，也会影响 MR 判读。

试验应使用新鲜纯培养物。混合菌会导致代谢产物相互干扰，造成假阳性或假阴性。VP 试剂容易受保存条件影响，α-萘酚、氢氧化钾等应按要求配制和保存。重要检测应设置已知 MR 阳性/VP 阴性菌株和 MR 阴性/VP 阳性菌株作为对照。

八、常见误区

第一，MR 阳性不是“只要能发酵葡萄糖”即可，而是必须产生足量稳定酸，使 pH 降至甲基红阳性范围。

第二，MR 颜色呈橙色不能直接判阳性。橙色通常为可疑，应复核。

第三，VP 试验需要氧化过程，加入试剂后应充分混匀并按规定时间观察。

第四，VP 阴性不能过早判读。显色慢的菌株需要足够反应时间。

第五，MR-VP 结果不能单独确定菌种。它只是细菌生化鉴定组合中的一部分。

九、小结

MR-VP 试验通过检测葡萄糖代谢终产物，区分细菌的不同发酵途径。MR 试验检测混合酸发酵产生的大量稳定酸，红色为阳性；VP 试验检测丁二醇发酵途径中的 acetoin，加入相应试剂后出现红色为阳性。两项试验常用于肠杆菌科细菌鉴别，尤其对大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、克雷伯菌、沙门氏菌等有参考价值。可靠结果依赖纯培养物、合格培养基、有效试剂、适宜培养时间和正确判读，并应与其他生化试验共同分析。