空肠弯曲菌的保藏方法与注意事项

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，旧称空肠弯曲杆菌）是一类微需氧、弯曲或螺旋状革兰阴性菌，对氧、干燥、温度波动和反复传代较敏感。与芽孢杆菌不同，空肠弯曲菌不形成芽孢，离开适宜环境后活力容易下降，因此菌种保藏应重点控制微需氧环境、培养时间、保存温度和复苏验证。

实验室保藏空肠弯曲菌时，应根据使用周期选择短期保藏或长期保藏。短期保藏适用于近期反复使用的工作菌株；长期保藏则更适合标准菌株、质控菌株和低频使用菌株。

一、空肠弯曲菌保藏的关键条件

空肠弯曲菌为典型微需氧菌，不能在普通空气中稳定生长。常用微需氧气体环境约为 85% 氮气、10% 二氧化碳和 5% 氧气。原文中“氮气 85%、二氧化碳 10%、氧气 6%”合计超过 100%，应修正为常用的 85∶10∶5 配比，或按商品化微需氧产气系统、厌氧罐/微需氧罐说明书执行。

培养温度通常采用 41～42℃左右以利于空肠弯曲菌生长，部分标准方法可使用 41.5℃或 42℃。原文中 41～44℃范围偏宽，实际操作应按具体标准、菌株来源和实验目的确定。温度过高或氧浓度过高，都可能导致菌体损伤或生长不良。

二、短期保藏方法

短期保藏可采用营养较丰富的液体培养基或血琼脂、巧克力琼脂斜面进行。原文所列酸水解酪素-酵母浸膏-氯化钠肉汤，可作为保藏或复壮培养基使用。该培养基含酸水解酪素、酵母浸膏、氯化钠和磷酸氢二钾，可为菌体提供氨基酸、小肽、维生素、无机盐和缓冲体系。

该培养基经高压灭菌后，pH 可按原方法控制在 8.5±0.2。需要注意，空肠弯曲菌常规培养基多接近中性至微碱性，若采用偏碱性保藏肉汤，应以标准方法或内部验证结果为依据，确认其对目标菌株的适用性。

短期保藏时，可将菌株接种于适宜肉汤中，在微需氧环境下培养至生长良好，再转接至血琼脂或巧克力琼脂斜面，在微需氧条件下培养。培养后的斜面可在低温条件下短期保存，并定期检查活力和纯度。若需要每周使用，可每周转接一次工作菌株；但不建议长期连续周转传代，以免菌株发生活力下降、污染或表型漂移。

三、长期保藏方法

长期保藏更推荐采用甘油保护液超低温冻存。常用做法是将新鲜培养物制成菌悬液，加入无菌甘油，使最终甘油浓度达到 10%～20%，分装于无菌冻存管中，置 -70℃、-80℃或更低温度保存。

甘油可减少冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，是细菌冻存中常用的保护剂。空肠弯曲菌对冻融较敏感，因此冻存时应小体积分装，避免同一冻存管反复冻融。使用时应取出一支工作冻存管复苏，用后不得再次冻回原管。

原文中“每 6 个月传代一次”的说法应谨慎理解。长期冻存菌株不宜为了“传代”而频繁解冻。更合理的管理方式是定期进行复苏活力检查和典型性验证；若发现活力下降或工作种子库存不足，再从主种子批重新建立工作种子批。

四、短期与长期保藏方式比较

五、复苏与质量控制

空肠弯曲菌复苏时，应尽量缩短菌株暴露于空气和室温的时间。复苏后应接种至适宜培养基，并立即置于微需氧环境培养。若复苏后生长缓慢、菌落形态异常或污染，应重新启用备用冻存管。

复苏后的菌株应检查纯度、菌落形态、革兰染色、运动性和典型生化特征。空肠弯曲菌常呈弯曲杆状、S 形或海鸥翼状，革兰阴性，具有特征性运动性。用于质控或标准检验时，还应记录菌株编号、来源、冻存批次、代次、复苏日期和使用记录。

六、常见问题与注意事项

第一，不能在普通空气中培养或保存空肠弯曲菌。氧浓度过高会导致菌体受损或死亡。

第二，短期传代只适合工作菌株，不适合长期维持标准菌株。连续传代会增加污染和性状改变风险。

第三，长期保藏应优先采用甘油超低温冻存，并建立主种子批和工作种子批。

第四，冻存管应一次性使用，避免反复冻融。

第五，复苏后不能只看“有无生长”，还应确认菌落形态、纯度和典型性。

七、生物安全要求

空肠弯曲菌属于常见食源性致病菌，实验室操作应符合相应生物安全要求。菌液制备、涡旋、离心、开盖和接种操作应避免产生气溶胶。培养物、污染耗材和废弃培养基应经过有效灭菌处理后再废弃。保存管应密封、清晰标识，并与其他菌株分区管理，避免误用和交叉污染。

八、小结

空肠弯曲菌的保藏难点在于其微需氧性和对环境应激的敏感性。短期保藏可采用肉汤或血琼脂、巧克力琼脂斜面，并在微需氧条件下定期转接；长期保藏更推荐使用 10%～20% 甘油保护液，在 -70℃或更低温度下冻存。实际管理中，应避免频繁传代和反复冻融，并通过复苏检查、纯度检查和典型性验证保证菌株质量。对于标准菌株和质控菌株，应建立完整的编号、代次、冻存和使用记录，确保检测结果稳定可靠。