滤膜法：原理、应用与微生物计数要点

滤膜法是微生物检验中常用的一类分离、浓缩和计数方法。它利用具有特定孔径的多孔膜截留微生物，使大量液体样品通过滤膜后，样品中的细菌、霉菌、酵母菌或其他微生物被富集在膜表面，再将滤膜转移到适宜培养基上培养并计数。该方法特别适合水、饮料、糖液、制药用水、无菌检查样品和低菌量液体样品的检测。

滤膜法的优势在于可处理较大体积样品，能提高低水平污染微生物的检出能力；局限是样品必须能够顺利过滤，若样品浑浊、黏稠、含颗粒或含脂肪较多，滤膜易堵塞，结果稳定性会受到影响。

一、滤膜法的基本原理

滤膜通常由硝酸纤维素、醋酸纤维素、混合纤维素酯、聚醚砜、聚偏氟乙烯等材料制成，具有均一孔径和一定机械强度。微生物检验中，常用滤膜孔径为 0.45 μm，可截留大多数细菌、酵母菌和霉菌孢子。对于体积较小的细菌或除菌过滤，常用 0.22 μm 或 0.2 μm 级滤膜。

过滤时，液体样品在负压或正压作用下通过滤膜，微生物被截留在膜表面。随后将滤膜置于浸有液体培养基的吸收垫上，或直接贴放于琼脂培养基表面。培养过程中，营养物质通过滤膜微孔扩散到膜表面，被截留的可培养微生物生长形成菌落。计数结果以 CFU/体积或 CFU/质量表示。

需要注意，平板上的一个菌落代表一个“可培养单位”，不一定等于一个单独细胞。若细胞成团、链状排列或附着在颗粒上，一个菌落可能来自多个细胞。

二、滤膜孔径与材料选择

滤膜孔径选择取决于检测目的。微生物计数常用 0.45 μm 滤膜；除菌过滤通常使用 0.22 μm 或 0.2 μm 级滤膜；若用于颗粒预过滤，可选择更大孔径的预滤膜。

带网格滤膜有利于菌落计数，尤其适合低菌量样品。白色滤膜常用于深色菌落观察，黑色滤膜常用于浅色菌落、荧光菌落或显微观察。滤膜材料应与样品和培养基相容，不能释放抑菌物质，也不能吸附影响目标微生物恢复的关键成分。

三、滤膜法的主要应用

滤膜法常用于饮用水、纯化水、注射用水、饮料、糖溶液、低浊度食品液体、环境水样和部分无菌液体的微生物检测。由于可过滤较大体积样品，滤膜法对低水平污染的检出能力通常高于直接取小体积平板计数。

在制药和生命科学试剂领域，滤膜法也常用于无菌检查和液体产品微生物限度检查。对于过滤性良好的样品，可将较大体积样品过滤后，将滤膜转移至相应培养基中培养，提高检出灵敏度。

滤膜还可用于液体或气体除菌过滤。此时目的不是计数，而是去除微生物。例如，热敏性培养基添加剂、抗生素溶液、维生素溶液和某些缓冲液可采用 0.22 μm 级滤膜除菌。应注意，除菌过滤不能可靠去除所有病毒、支原体、内毒素或可溶性毒素。

四、滤膜培养方式

滤膜截留微生物后，常见培养方式有两种：一是将滤膜放在含液体培养基的无菌吸收垫上；二是将滤膜直接贴放于琼脂培养基表面。

吸收垫法常用于商品化滤膜检测系统。吸收垫吸附适量液体培养基，通过毛细作用为滤膜上的微生物提供营养。该方式培养基用量少，适合标准化检测。

琼脂培养基表面培养更接近常规平板培养。滤膜应与琼脂表面充分贴合，避免气泡，否则气泡区域营养接触不足，可能影响菌落形成。

使用选择性培养基时，应特别关注方法适用性。选择性成分从琼脂向滤膜扩散的速度、浓度和均一性可能与普通平板表面直接接种不同，从而影响选择性和回收率。因此，滤膜法使用选择性培养基前应进行适用性验证。

五、常规操作流程概述

滤膜法通常包括滤器灭菌、滤膜放置、样品过滤、冲洗、滤膜转移、培养和计数几个环节。

检测前应保证滤器、漏斗、镊子、滤膜、吸收垫和培养皿无菌。滤膜放置时，有网格的一面通常朝上。样品过滤后，可用无菌稀释液冲洗漏斗内壁，减少样品残留和抑菌物质影响。原文中的“25% Ringer 氏溶液”更规范应为 1/4 Ringer 氏溶液，也可根据方法选择无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液或蛋白胨盐水等。

过滤完成后，用无菌镊子将滤膜转移到吸收垫或琼脂培养基表面。放置时应避免产生气泡，并使膜面平整贴合。培养后观察菌落形态并计数，必要时挑取典型菌落进行确认。

六、结果计数与表达

滤膜法计数应选择菌落分布均匀、数量适宜的滤膜进行。若菌落过多、融合或背景菌蔓延，结果不宜准确计数；若菌落过少，则应结合过滤体积和检出限表达。

结果通常按以下方式换算：

样品菌数 = 滤膜菌落数 × 稀释倍数 ÷ 过滤样品体积

若样品为液体，常表示为 CFU/mL 或 CFU/100 mL；若样品经称量后制备稀释液过滤，可表示为 CFU/g。对于水质检测，常见表达方式为 CFU/100 mL。

当未见菌落时，不应简单写“0”，而应结合过滤体积报告为“小于检出限”，例如“＜1 CFU/100 mL”。

七、滤膜染色与显微观察

有时菌落颜色与滤膜背景反差较小，影响计数。可采用适当染色方法增强对比。例如，孔雀绿可使滤膜背景着色而菌落相对不染色；亚甲基蓝可使菌落与膜背景形成差异，便于计数。

滤膜经适当透明化处理后，也可用于显微镜观察。亚甲基蓝、结晶紫等染料可用于显示膜上微生物。但显微镜观察通常用于辅助判断，不能完全替代培养计数。因为显微镜下可见细胞不一定具有培养活性，培养法计数的是可培养微生物。

八、样品适用性与前处理

滤膜法最适合清澈、低颗粒、低黏度液体样品。若样品含大量悬浮颗粒、蛋白、脂肪、胶体或糖浆状成分，滤膜容易堵塞，过滤时间延长，甚至无法完成过滤。

乳和乳制品、含脂肪饮料或复杂食品样品通常需要前处理，如稀释、均质、去脂、酶处理、表面活性剂处理或预过滤。但任何前处理都可能影响微生物回收率，因此必须验证不会抑制目标菌，也不会造成目标菌损失。

对于含抑菌剂、消毒剂或防腐剂的样品，滤膜过滤后应采用合适冲洗液冲洗滤膜，必要时使用含中和剂体系，以降低残留抑菌物质对培养结果的影响。

九、滤膜法的优点与局限

滤膜法能提高低菌量样品检出能力，但并不自动等同于更准确。若样品过滤性差、抑菌物质残留或滤膜与培养基不匹配，结果可能偏低甚至假阴性。

十、常见问题与注意事项

第一，滤膜孔径应按检测目的选择。微生物计数常用 0.45 μm，除菌过滤通常用 0.22 μm 或 0.2 μm。

第二，样品过滤性必须评估。浑浊、黏稠或含颗粒样品可能堵膜。

第三，滤膜转移时要避免气泡。气泡会造成局部营养接触不良。

第四，选择性培养基需验证。滤膜法下选择剂扩散状态可能不同于普通平板。

第五，过滤后冲洗很重要。冲洗可减少样品残留和抑菌物质影响。

第六，未检出结果应按检出限报告，不能简单等同于绝对无菌。

第七，除菌过滤与滤膜计数目的不同。前者用于去除微生物，后者用于截留并培养微生物。

十一、小结

滤膜法利用特定孔径滤膜截留微生物，再通过培养实现分离和计数，适合水、饮料、糖溶液、制药用水、无菌液体和低菌量样品检测。常规微生物计数多用 0.45 μm 滤膜，除菌过滤多用 0.22 μm 或 0.2 μm 级滤膜。该方法的关键在于滤膜选择、样品过滤性、无菌操作、冲洗步骤、培养基适用性和结果换算。对于复杂样品，应通过方法适用性和回收率验证确认滤膜法是否可靠。