大肠菌群和大肠埃希氏菌菌落计数方法

大肠菌群和大肠埃希氏菌是食品、水质、环境和生产过程卫生评价中常用的指示菌。大肠菌群主要用于反映卫生状况、加工后污染或环境污染风险；大肠埃希氏菌则更常作为粪源污染的重要指标。二者概念相关但不相同，检测和结果解释也不能混用。

大肠菌群通常指在一定培养条件下能发酵乳糖产酸、产气的一类革兰氏阴性、无芽孢杆菌，常包括大肠埃希氏菌、肠杆菌、克雷伯菌、柠檬酸杆菌等。大肠埃希氏菌是大肠菌群中的一个重要成员，但并非所有大肠菌群都是大肠埃希氏菌。因此，报告结果时应明确是“大肠菌群计数”还是“大肠埃希氏菌计数”。

一、平板计数法

大肠菌群平板计数常用紫红胆盐乳糖琼脂（VRBA）。该培养基中胆盐和结晶紫可抑制多数革兰氏阳性菌，乳糖为可发酵糖，指示剂可显示产酸反应。大肠菌群发酵乳糖产酸后，菌落通常呈红色至紫红色，周围可形成胆盐沉淀环。

常规操作中，将样品制成适宜稀释液后，取一定体积加入培养皿，再加入冷却至约 45℃的熔化 VRBA 混匀。待凝固后，可再覆盖一层薄琼脂，以限制蔓延生长并增强菌落典型性。培养后选择菌落数适宜的平板计数典型菌落。

典型大肠菌群菌落多为深红色或紫红色，直径一般约 0.5 mm 或更大，菌落周围常有红色或紫红色胆盐沉淀环。若菌落密集、相互靠近或样品背景复杂，菌落可能偏小或形态不典型，此时应进行确认试验。

二、VRBA 结果判读与确认

VRBA 是选择性和鉴别性培养基，但并不能保证所有典型菌落都是真正的大肠菌群，也不能保证所有大肠菌群都表现典型。因此，对可疑菌落或低稀释度样品中的典型菌落，通常需要进一步确认。

确认方法可将可疑菌落转接至乳糖肉汤、亮绿乳糖胆盐肉汤、麦康凯肉汤或其他规定培养基中，观察是否产酸产气；也可结合氧化酶试验、革兰氏染色和其他生化鉴定。若需要确认大肠埃希氏菌，可进一步进行吲哚、β-葡萄糖醛酸苷酶、EC 肉汤高温培养或显色培养基确认，具体应按相应标准方法执行。

需要注意，某些食品中含有非乳糖碳水化合物、酸性成分、色素、抑菌物质或大量背景菌，可能影响 VRBA 菌落颜色和沉淀环表现。低稀释度样品带入较多食品基质时，更容易出现假阳性、假阴性或菌落形态异常。

三、大肠埃希氏菌计数的特点

大肠埃希氏菌计数通常比大肠菌群计数更有粪源污染指示意义。常用检测思路包括：利用其在适宜条件下发酵乳糖、产生吲哚、具有 β-葡萄糖醛酸苷酶活性，或能在特定温度下生长等特征进行鉴别。

但并非所有大肠埃希氏菌都具有典型 β-葡萄糖醛酸苷酶活性。例如部分大肠埃希氏菌 O157:H7 常表现为 β-葡萄糖醛酸苷酶阴性。因此，若检测目的涉及特定致病性大肠埃希氏菌，不能只依赖普通大肠埃希氏菌计数方法，应采用专门的选择性分离和确认流程。

四、干燥复水膜计数法

干燥复水膜是一类商品化微生物计数系统，常用于大肠菌群和大肠埃希氏菌的快速计数。其基础通常包含选择性营养成分、胆盐类抑制剂、指示剂和显色底物。检测时加入样品稀释液后，干燥培养基复水形成薄层培养体系，培养后根据菌落颜色和气泡判断结果。

用于大肠埃希氏菌检测的复水膜常加入 β-葡萄糖醛酸苷酶显色底物，如 BCIG 或 X-Gluc 类底物。具有 β-葡萄糖醛酸苷酶活性的菌株可形成蓝色或蓝绿色菌落；若同时发酵乳糖产气，可伴随气泡。大肠菌群则通常根据产酸、产气和颜色变化进行判读。

干燥复水膜的优点是操作简便、标准化程度高、读数直观、占用空间小，适合批量样品检测和企业日常质控。但其判读规则必须严格依据产品说明和适用标准执行，不能简单把“蓝色菌落”或“有气泡菌落”脱离方法体系单独解释。

五、滤膜法

滤膜法常用于饮用水、纯化水、环境水样和低菌量液体样品中大肠菌群或大肠埃希氏菌检测。其原理是将一定体积样品通过特定孔径滤膜，使微生物截留在膜表面，然后将滤膜转移到选择性或显色培养基上培养计数。

滤膜法的优势是可处理较大体积样品，适合低水平污染检测。例如饮用水中目标菌数量通常较低，直接取少量样品平板计数灵敏度不足，而滤膜法可过滤 100 mL 或更大体积，提高检出能力。

滤膜法也有局限。浑浊、含颗粒、含脂肪或黏稠样品容易堵膜；样品中的消毒剂、重金属或防腐剂残留可能影响菌体复苏；选择性培养基对受损菌可能抑制较强。因此，水样或复杂液体样品检测时，必要时应使用合适冲洗液、中和剂或复苏步骤，并进行方法适用性验证。

六、三种方法的比较

实际选择方法时，应根据样品类型、目标菌、预期污染水平、检测标准、实验室条件和确认需求决定。食品样品常用平板计数或复水膜法；水样更常用滤膜法；低水平污染或需要液体增菌的样品可采用 MPN 法。

七、结果报告与质量控制

大肠菌群和大肠埃希氏菌计数结果通常以 CFU/g、CFU/mL、CFU/100 mL 或 MPN/g、MPN/mL 表示。报告时应注明检测方法、培养基、培养温度、培养时间和确认方式。若未检出，应按方法检出限报告，如“＜1 CFU/g”或“未检出/规定样品量”，而不宜简单写“0”。

质量控制应包括培养基外观、pH、无菌性、促生长能力、选择性和指示反应检查。阳性对照菌株应表现典型菌落或显色反应，阴性或非目标菌应被抑制或表现非典型反应。若质控菌株表现异常，应先排查培养基批次、灭菌条件、培养温度、稀释液和操作过程，再解释样品结果。

八、常见误区

第一，大肠菌群不等于大肠埃希氏菌。大肠菌群是一个菌群概念，大肠埃希氏菌只是其中重要成员。

第二，VRBA 上红色菌落不一定都是真正大肠菌群，必要时需确认。

第三，未检出大肠菌群不等于样品绝对安全。病毒、寄生虫或某些致病菌可能不被该指标反映。

第四，β-葡萄糖醛酸苷酶阳性可辅助判断大肠埃希氏菌，但不能覆盖所有特殊类型大肠埃希氏菌。

第五，不同方法结果不能随意横向比较。VRBA、复水膜、滤膜法和 MPN 法的检测对象、选择压力和检出限不同。

九、小结

大肠菌群和大肠埃希氏菌计数是卫生指示菌检测的重要内容。VRBA 平板计数法适合食品中大肠菌群的常规计数，典型菌落呈红色至紫红色并可伴胆盐沉淀环；干燥复水膜法操作简便，可通过显色底物和产气反应辅助判读大肠菌群和大肠埃希氏菌；滤膜法适合水样和低菌量液体样品，可通过过滤较大体积提高检出能力。实际检测中，应明确检测对象，合理选择培养基和方法，并通过确认试验和质量控制保证结果可靠。