供试品处理及接种培养基——薄膜过滤法

薄膜过滤法是药品、部分医疗器械和无菌制品无菌检查中的常用方法。其基本原理是将供试品通过微孔滤膜过滤，使样品中可能存在的微生物被截留在滤膜表面，再将滤膜转入适宜培养基中培养，观察是否有微生物生长。与直接接种法相比，薄膜过滤法可以通过冲洗滤膜去除或降低供试品中的抑菌成分，特别适用于可过滤液体、抗生素制剂、含防腐剂制剂以及需要减少供试品对培养基干扰的样品。

一、薄膜过滤法的基本要求

薄膜过滤法宜优先采用封闭式薄膜过滤系统，也可使用经验证适用的一般薄膜过滤装置。封闭式系统能减少样品、滤膜和培养基暴露机会，降低外源污染风险，更适合无菌检查这类对操作环境和无菌技术要求较高的试验。

无菌检查用滤膜孔径通常应不大于 0.45 μm，常用直径约为 50 mm。滤膜材质应根据供试品性质选择，例如水溶性样品、油性样品、含表面活性剂样品、抗生素样品对滤膜兼容性和吸附性的要求不同。对于抗生素类供试品，应优先选择低吸附滤器和滤膜，避免药物吸附在滤膜上后持续抑制微生物生长，造成假阴性风险。

滤器和滤膜使用前应采用适宜方法灭菌，并在使用前后确认滤膜完整性。若滤膜破损、皱折、密封不严或过滤过程中出现旁路泄漏，试验结果可能失去可靠性。

二、过滤前处理与滤膜冲洗

水溶性供试液过滤前，可先用少量适宜冲洗液润湿滤膜，使滤膜表面充分湿润，减少过滤阻力并提高过滤均一性。油类供试品过滤前，滤膜和过滤器应保持充分干燥，避免水分影响油性样品通过滤膜。

过滤过程中，应尽量使供试品溶液和冲洗液覆盖整个滤膜表面，避免局部干膜或局部高浓度药物残留。供试液过滤后，如供试品具有抑菌性、含防腐剂或存在影响微生物恢复的成分，应按方法适用性试验确认的冲洗液、冲洗次数和冲洗量冲洗滤膜。

一般情况下，每张滤膜每次冲洗量可为 100 mL，总冲洗量不宜过大。冲洗不足可能导致抑菌物质残留，冲洗过度则可能损伤或冲走滤膜上的微生物，均会影响结果。因此，冲洗条件不能凭经验随意确定，应通过方法适用性试验证明既能消除抑菌影响，又不会影响微生物回收。

三、水溶液和可溶性固体制剂的处理

水溶液供试品通常可取规定量直接过滤；若样品浓度较高、黏度较大或需要稀释，可加入适量无菌稀释液混匀后立即过滤。若供试品含有抑菌成分或防腐剂，应过滤后用经验证的冲洗液充分冲洗滤膜。

可溶于水的固体制剂，应按规定量取样，用适宜无菌稀释液溶解，或按标签说明复溶后过滤。溶解过程中应避免加热过度、剧烈处理或长时间放置，以免影响样品中可能存在微生物的存活状态。固体制剂完全溶解后，应尽快过滤，减少微生物沉降、损伤或污染风险。

过滤完成后，通常将滤膜分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。前者主要用于厌氧菌和部分需氧菌培养，后者主要用于需氧菌和真菌培养。无菌检验培养基应经过无菌性检查和促生长能力检查，确保能够支持规定试验菌生长。

四、β-内酰胺类抗生素供试品

β-内酰胺类抗生素包括青霉素类、头孢菌素类等，其残留在滤膜、滤筒或培养基中时，可能抑制污染微生物生长，导致假阴性。因此，这类供试品采用薄膜过滤法时，重点是消除抗生素残留影响。

处理时可按水溶液或固体制剂供试品的方法过滤，并用适宜冲洗液冲洗滤膜。必要时，可使用含适量 β-内酰胺酶的冲洗液清除残留在滤筒和滤膜上的抗生素，也可在培养基中加入经验证适量的 β-内酰胺酶，或将滤膜直接接种至含 β-内酰胺酶的培养基中。酶的用量和使用方式应经过方法适用性试验确认，既要能灭活抗生素，又不能抑制试验菌生长。

五、非水溶性制剂和油性样品

非水溶性制剂可在供试品特性允许时直接过滤；若无法直接过滤，可将样品混悬或乳化于含聚山梨酯 80 或其他适宜乳化剂的无菌稀释液中，充分混匀后立即过滤。聚山梨酯 80 可帮助油性或疏水性成分分散，提高过滤和微生物释放效果。

过滤后，常用含 0.1%～1% 聚山梨酯 80 的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数通常不少于三次，具体条件应以方法验证结果为准。滤膜随后可接种至含或不含聚山梨酯 80 的培养基中培养。需要注意的是，乳化剂本身也应验证其对微生物无毒性，不应因改善样品分散而影响微生物恢复。

六、膏剂和黏性油剂供试品

可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂，可取规定量加入适量无菌十四烷酸异丙酯中，充分振摇使其溶解。必要时可适当加温帮助溶解，但温度不应过高，以免损伤可能存在的微生物。原文中“温度不得超过 44℃”可作为操作控制思路，实际应按药典方法、产品特性和方法适用性试验确认执行。

若样品仍无法直接过滤，可在含无菌十四烷酸异丙酯的供试液中加入不少于规定量的无菌稀释液，充分振摇萃取，静置分层后取水相作为供试液过滤。随后按非水溶性制剂的要求冲洗滤膜并接种培养基。

七、气雾剂、预充式注射器和带导管器具

无菌气雾剂或喷雾剂供试品处理时，应在保证安全和无菌操作的前提下释放抛射剂，再转移内容物进行过滤。由于气雾剂容器结构特殊，操作中既要避免外源污染，也要防止压力释放造成样品损失或人员风险。具体冷冻、开孔、释放和转移方式应按经验证的实验室操作规程执行。

装有药物的注射器供试品，可排出内容物后直接过滤；若需要，可吸入无菌稀释液或标签所示溶剂溶解、洗脱后过滤。对于包装中配带的无菌针头，不能只检查药液内容物，还应按适宜方法对针头进行无菌检查，必要时采用直接接种法。

具有导管的医疗器具，如输液袋、输血袋、导管类产品等，可用规定体积的无菌冲洗液冲洗内壁，收集冲洗液后按水溶性供试品方法过滤。若包装中配带针头、连接件或其他附件，也应纳入检查范围，避免只检测主体而遗漏关键接触部件。

八、接种培养基与培养观察

滤膜过滤和冲洗完成后，应将滤膜转入相应培养基中培养。常用培养基包括硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。培养期间应按规定温度和时间培养，并定期观察是否出现浑浊、沉淀、菌膜、絮状物或其他微生物生长迹象。无菌检验中含培养基的容器通常需培养不少于 14 天，并定期观察记录。

若供试品本身颜色深、浑浊、含油或含微粒，可能影响培养基外观判断。遇到培养基浑浊但无法直接判断是否有菌生长的情况，应按规定进行转种、镜检或其他确认处理，不能简单按外观下结论。

九、方法适用性试验是关键

薄膜过滤法的核心不是“能过滤”，而是“能真实检出可能存在的微生物”。因此，方法适用性试验是该方法可靠性的关键。方法适用性试验应证明所选滤膜、稀释液、冲洗液、中和剂、灭活剂、乳化剂和培养基组合，能够消除供试品抑菌性，同时不损伤或抑制试验微生物。

当供试品处方、浓度、包装、过滤装置、滤膜材质、冲洗条件或培养基发生变化，并可能影响检验结果时，应重新评估方法适用性。尤其是抗生素、防腐剂、含表面活性剂制剂、油性制剂、黏稠制剂和复杂医疗器械样品，更不能照搬通用流程。

十、常见问题与控制要点

薄膜过滤法常见问题包括滤膜堵塞、过滤速度过慢、滤膜破损、样品吸附、抑菌物质残留、冲洗过度、培养基浑浊干扰观察以及操作污染造成假阳性。解决这些问题应从样品预处理、滤膜材质、稀释液选择、冲洗条件、封闭式过滤系统和无菌操作控制等方面综合优化。

对于培养基生产和应用单位而言，薄膜过滤法相关培养基应重点关注促生长能力、无菌性、pH、澄清度、还原状态、批间稳定性以及与中和剂、酶制剂或表面活性剂的兼容性。对于检验实验室而言，记录应覆盖样品数量、过滤量、冲洗液种类和体积、滤膜编号、培养基批号、培养条件、观察时间和异常情况，保证结果可追溯。

总体来看，薄膜过滤法适用于多类可过滤供试品，是无菌检查中兼具灵敏度和适用性的常用方法。但其结果可靠性依赖于方法适用性试验、滤膜完整性、冲洗控制、培养基质量和严格无菌操作。只有这些环节同时受控，才能降低假阴性和假阳性风险，保证无菌检查结果准确可靠。