供试品处理及接种培养基——直接接种法

直接接种法是无菌检查中的常用方法之一，适用于部分不能采用薄膜过滤法处理，或过滤困难、易堵膜、形态特殊的供试品。其基本思路是将规定量供试品直接接种至适宜培养基中，通过培养观察判断是否有微生物生长。与薄膜过滤法相比，直接接种法操作路径相对直接，但更容易受到供试品本身颜色、浑浊度、抑菌性、黏度和用量的影响，因此必须重视方法适用性试验和培养基用量控制。

一、直接接种法的基本要求

直接接种法通常是取规定量供试品，分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌培养，也可兼顾部分需氧菌；胰酪大豆胨液体培养基主要用于需氧菌和真菌培养。二者配合使用，可提高不同类型污染微生物的检出机会。

除另有规定外，每个容器中供试品接种体积一般不得大于培养基体积的 10%。这一要求的核心目的，是避免供试品过量稀释或干扰培养基体系，同时降低供试品中抑菌成分对微生物恢复和生长的影响。硫乙醇酸盐流体培养基每管装量通常不少于 15 mL，胰酪大豆胨液体培养基每管装量通常不少于 10 mL。实际培养基用量、装量高度和接种方式，应与方法适用性试验确认条件保持一致。

二、混悬液和非澄清水溶液供试品

混悬液、乳浊液或其他非澄清水溶液供试品，可按规定量充分混匀后直接接种至各管培养基中。此类样品的关键在于接种前必须混匀，避免有效成分、颗粒或可能存在的微生物分布不均，造成取样偏差。

对于本身浑浊或有沉淀的供试品，培养过程中外观判断可能受干扰。接种后若培养基原本即出现浑浊，应在试验记录中注明，并在培养期间重点观察浑浊程度变化、沉淀形态变化、菌膜、絮状物、气泡或其他微生物生长迹象。必要时应进行转种或镜检辅助判断。

三、固体制剂供试品

固体制剂可按规定量直接加入培养基中，也可先用适宜无菌溶剂溶解，或按标签说明复溶后，再取规定量接种至培养基中。对于片剂、粉末、冻干制剂等样品，应关注其是否能在培养基或稀释液中充分分散，避免因局部高浓度药物或辅料造成抑菌影响。

若固体制剂含有抗菌活性成分、防腐剂或高浓度渗透压成分，不能简单直接接种后判断结果，应通过方法适用性试验证明该供试品在规定接种量下不会抑制微生物生长，或其抑菌作用已被适当中和、稀释或灭活。

四、有抑菌活性供试品

具有抑菌活性的供试品是直接接种法中最需要关注的一类样品。抗生素、防腐剂、消毒剂残留、某些表面活性剂、高盐或极端 pH 制剂，都可能抑制培养基中的微生物生长，导致假阴性。

处理这类样品时，可先将规定量供试品与适宜无菌中和剂或灭活剂混合，再接种至培养基中；也可直接接种至含有适量中和剂或灭活剂的培养基中。中和剂的种类和用量不能凭经验添加，必须通过方法适用性试验证明其既能消除供试品抑菌作用，又不会影响试验菌恢复和生长。

五、非水溶性制剂供试品

非水溶性制剂如油性制剂、软膏、乳膏、脂溶性样品等，可加入适量聚山梨酯 80 或其他适宜乳化剂和稀释剂，使样品充分乳化后接种至培养基中。也可直接接种至含有适宜乳化剂的培养基中。

乳化的目的，是使供试品尽可能均匀分散，释放可能存在的微生物，并降低油性或疏水性成分对培养基体系的物理干扰。需要注意的是，乳化剂本身应无菌，并应验证其对微生物无抑制作用。若乳化不充分，样品可能形成油层、团块或附着于容器壁，影响微生物与培养基充分接触。

六、敷料、缝合线和一次性医用材料

敷料类供试品可按规定数量无菌拆开包装，从不同部位剪取规定大小或质量的样品，接种于足以完全浸没供试品的培养基中。选择不同部位取样，是为了提高样品代表性，避免只检测局部区域造成漏检。

肠线、缝合线及其他一次性使用医用材料，应按规定量取最小包装，无菌开启后直接接种至足以浸没供试品的培养基中。此类样品表面积较大、形态不规则，接种时应确保培养基能充分接触样品表面和内部缝隙。若材料漂浮，可采用经验证的方式使其浸没，但不能引入外源污染或影响微生物生长。

七、灭菌医用器具供试品

灭菌医用器具可按规定量取样，必要时在无菌条件下拆散或切成小段，再接种至足以浸没供试品的培养基中。对于导管、接头、腔道、缝隙较多的器具，应关注内表面和难清洁部位的微生物检出风险。

若器具体积较大、形态复杂或无法完全浸没，应按经验证的方法进行处理，例如采用洗脱液冲洗后检测，或将关键接触部件分段接种。无论采用何种方式，都应保证供试品代表性和微生物恢复能力。

八、放射性药品

放射性药品具有特殊性，既要满足无菌检查要求，也要兼顾辐射安全、操作时间和人员防护。原资料中提到可取供试品 1 瓶或 1 支，每管接种一定体积至较小装量培养基中。实际检验时，应按放射性药品相关规定、品种要求和经验证的方法执行，确保在规定时间内完成接种，同时避免供试品体积过大影响培养基性能。

放射性药品的直接接种法尤其需要关注方法适用性和操作可行性，因为样品活度、半衰期、接种时间和培养观察条件均可能影响试验安排。

九、培养与观察

接种完成后的培养基容器应按规定温度培养 14 天，并在培养期间定期观察和记录是否有微生物生长。观察内容包括培养基浑浊、絮状物、沉淀变化、菌膜形成、颜色变化、气体产生等。记录应包括观察日期、培养状态、异常现象和处理措施。

如果加入供试品后培养基立即变浑浊，或培养过程中因供试品本身特性导致无法从外观判断是否有微生物生长，可在培养 14 天后取适量培养液转种至同种新鲜培养基中继续培养。通常细菌转种培养观察约 2 天，真菌转种培养观察约 3 天；也可取培养液涂片、染色、镜检，辅助判断是否存在微生物。

十、直接接种法的常见问题

直接接种法常见问题包括供试品抑菌作用未消除、接种量过大、培养基被样品颜色或浑浊干扰、非水溶性样品乳化不充分、固体样品未完全浸没、材料样品表面接触不足，以及无菌操作不严导致假阳性。

其中，最容易被忽视的是抑菌作用。供试品直接进入培养基后，如果残留抗菌成分未被中和或充分稀释，即使样品中存在少量微生物，也可能无法生长。因此，直接接种法不应只关注“是否接种进去”，而应关注“接种后是否仍能支持微生物生长”。

十一、小结

直接接种法适用于多类不便过滤或不宜过滤的供试品，是无菌检查的重要方法之一。其优点是操作相对直接，适用于固体材料、器械部件、非澄清制剂和部分特殊样品；其局限是容易受到供试品抑菌性、浑浊度、黏度、颜色和接种体积的影响。

要保证直接接种法结果可靠，应重点控制五个环节：供试品代表性、培养基用量和装量、抑菌成分中和或灭活、样品与培养基充分接触、培养观察和异常结果确认。对于培养基研发和质量控制而言，硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基不仅要满足无菌性和促生长能力要求，还应在实际样品体系中保持稳定、可观察、可判断。