PFGE 概述：原理、作用与基本流程

PFGE，即脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），是一种用于分离大分子 DNA 片段的电泳技术。普通琼脂糖凝胶电泳适合分离较小 DNA 片段，而细菌染色体经限制性内切酶酶切后常形成几十 kb 至数百 kb 的大片段，普通电泳难以有效分开。PFGE 通过周期性改变电场方向，使大分子 DNA 在凝胶中重新取向并逐步迁移，从而实现大片段 DNA 的分离。

在食品微生物、公共卫生监测和传染病溯源中，PFGE 曾长期用于细菌分子分型。不同菌株的染色体 DNA 经特定限制性内切酶切割后，会形成不同数量和大小的 DNA 条带。通过比较条带图谱，可以判断不同分离株之间的遗传相关性，为食品污染溯源、暴发事件调查和传播链分析提供依据。

一、PFGE 的主要作用

PFGE 的核心作用是获得细菌的 DNA 指纹图谱。细菌染色体 DNA 经限制性内切酶切割后，可产生多个约 10～800 kb 的 DNA 片段。片段在脉冲电场中分离后形成条带图谱，不同菌株的条带数量、位置和大小可能存在差异。通过图谱比对，可以分析菌株之间是否具有较高同源性。

在食源性致病菌监测中，PFGE 常用于沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌 O157、志贺氏菌、弧菌等菌株分型。若来自患者、食品、环境或生产环节的分离株 PFGE 图谱高度一致，提示它们可能来源相同或存在传播关联。反之，若图谱差异明显，则提示它们可能不是同一污染来源。

需要注意的是，PFGE 结果只能说明菌株遗传图谱的相似程度，不能单独证明传播关系。最终溯源判断仍需结合流行病学调查、样品来源、采样时间、生产链信息和其他实验室证据。

二、PFGE 的技术原理

PFGE 与普通琼脂糖凝胶电泳的区别在于电场方向会按设定程序周期性变化。大分子 DNA 在凝胶孔隙中迁移时，需要不断改变构象并重新排列方向。DNA 片段越大，重新取向所需时间越长，迁移速度越慢；DNA 片段越小，重新取向较快，迁移速度相对较快。利用这一差异，PFGE 能将普通电泳难以分开的大片段 DNA 分离出来。

为了避免大片段染色体 DNA 在提取过程中被机械剪切，PFGE 通常不是直接提取游离 DNA，而是先将细菌包埋在低熔点琼脂糖胶块中。随后在胶块内进行细胞裂解、蛋白降解、洗涤和限制性内切酶酶切。这样可以最大限度保持染色体 DNA 的完整性，获得稳定、可重复的条带图谱。

三、PFGE 的基本流程

PFGE 的实验流程大致包括菌体制备、胶块制备、细胞裂解、胶块洗涤、限制性内切酶酶切、脉冲场电泳、凝胶染色、成像和图谱分析几个环节。

首先，选取新鲜纯培养菌落制备均一的菌悬液，并调整至适宜浓度。菌体浓度过低会导致条带过浅，浓度过高则可能出现条带拖尾、背景深或酶切不充分。

第二步是胶块制备。将菌悬液与低熔点琼脂糖混合，使细菌固定在胶块中。随后在胶块内进行细胞裂解。裂解液通常含有去污剂和蛋白酶，用于破坏细胞结构、降解蛋白质并释放染色体 DNA。由于 DNA 被固定在胶块中，能减少剪切损伤。

第三步是洗涤胶块。裂解后的胶块需要多次洗涤，以去除蛋白酶、去污剂、盐类和其他可能影响后续酶切的成分。洗涤是否充分会直接影响限制性内切酶活性和条带清晰度。

第四步是限制性内切酶酶切。根据目标菌种选择合适的限制性内切酶，将胶块中的染色体 DNA 切割成较大 DNA 片段。不同菌种常用酶不同，酶切条件也应按标准方法或实验室验证方法执行。酶切不充分会导致大片段残留、条带模糊或图谱不可比。

第五步是电泳分离。将酶切后的胶块嵌入琼脂糖凝胶孔中，加入电泳缓冲液，在低温循环条件下进行脉冲场电泳。电泳条件包括脉冲时间、运行时间、电场强度、夹角、缓冲液浓度和温度等，均会影响条带分离效果。电泳结束后，对凝胶进行染色、脱色和成像，获得 DNA 指纹图谱。

最后，通过专用软件或标准化方法对条带进行归一化、比对和聚类分析。通常需要使用分子量标准或参考菌株作为图谱校准依据，以提高不同批次、不同实验室结果之间的可比性。

四、PFGE 结果如何解读

PFGE 图谱解读主要观察 DNA 条带数量、位置和大小差异。条带完全一致或高度相似，说明菌株之间遗传相关性较高；条带差异较多，则提示菌株来源可能不同。对于暴发调查，可将患者分离株、可疑食品分离株、环境分离株和生产链分离株进行图谱比较，从而辅助判断污染来源和传播路径。

但 PFGE 解读不能机械化。部分遗传上相近的菌株可能因小范围基因变异、质粒变化或限制性酶切位点变化而出现条带差异；反过来，不同来源菌株也可能出现相似图谱。因此，PFGE 图谱应与流行病学证据、采样信息、菌株鉴定结果和其他分子检测结果共同解释。

五、PFGE 的优势

PFGE 的主要优势是分辨率较高、重复性较好、图谱直观，曾长期作为细菌分子分型的重要方法。对于许多食源性致病菌，PFGE 可有效区分不同菌株，并在暴发溯源中发挥重要作用。由于该方法在公共卫生网络中长期应用，积累了大量历史图谱数据，便于与既往菌株进行比较。

此外，PFGE 不需要测序平台，实验室在具备相应电泳设备、标准菌株和图谱分析能力后，即可开展分子分型。对于一些仍需与历史数据库比对的场景，PFGE 仍具有参考价值。

六、PFGE 的局限性

PFGE 也存在明显局限。首先，它反映的是限制性酶切图谱差异，不能提供具体基因序列信息，无法直接解析毒力基因、耐药基因、突变位点或进化关系。其次，实验周期较长，对操作一致性要求高，胶块制备、裂解、洗涤、酶切和电泳参数都会影响结果。再次，不同实验室之间如果标准化不足，图谱可比性会下降。

近年来，全基因组测序（WGS）在食源性病原菌监测中快速发展。WGS 可以读取菌株全基因组序列，获得更高分辨率和更丰富的信息，用于菌株聚类、溯源、耐药基因分析和毒力基因分析。CDC PulseNet 等公共卫生网络已将 WGS 作为食源性病原体分型的重要技术方向，WGS 在许多场景中已经替代或正在替代 PFGE。

因此，PFGE 更适合被理解为一种经典、成熟、历史数据丰富的分子分型技术，而不是当前所有场景中分辨率最高的方法。

七、常见影响因素

PFGE 结果质量受多个环节影响。菌体状态会影响 DNA 完整性，新鲜纯培养物通常更利于获得清晰条带。菌悬液浓度过高或过低会影响条带强度。胶块制备时若混匀不充分或产生气泡，会导致 DNA 分布不均。裂解不彻底会影响 DNA 释放和酶切。洗涤不足会抑制限制性内切酶。酶切条件不合适会造成不完全酶切。电泳温度、缓冲液浓度和脉冲参数不稳定，则会造成条带弯曲、拖尾或分离不佳。

图谱分析阶段也需要标准化。不同凝胶之间迁移距离不同，必须使用统一分子量标准进行归一化；条带识别参数设置不同，也可能影响相似性计算和聚类结果。因此，PFGE 实验不仅是电泳操作，更是一套标准化分子分型流程。

八、PFGE 与食品安全溯源

在食品安全事件中，PFGE 可用于比较来自不同来源的分离株。例如，若患者样本、可疑食品样本和生产环境样本中的沙门氏菌 PFGE 图谱高度一致，就提示三者可能存在共同来源。监管和企业可据此结合生产批次、流通路径、环境监测和流行病学资料，进一步追踪污染环节。

对于食品生产企业，PFGE 也可用于环境分离株的长期跟踪。如果同一加工区域、不同时间反复检出图谱相同或高度相似的菌株，提示该菌株可能在生产环境中持续定植，需要重点排查设备死角、排水系统、冷凝水、人员流线和清洁消毒效果。

九、小结

PFGE 是一种经典的细菌分子分型技术，通过限制性内切酶切割染色体 DNA，并利用脉冲场凝胶电泳分离大片段 DNA，形成具有菌株特征的 DNA 指纹图谱。它曾在食源性致病菌监测、暴发调查和菌株同源性分析中发挥重要作用。

PFGE 的价值在于图谱直观、重复性较好、历史数据丰富，适合进行菌株相关性比较和污染线索追踪。但它不能提供全基因组水平信息，分辨率和数据深度已不如全基因组测序。当前应用中，应根据实验室条件、历史数据库、监管要求和检测目的，合理选择 PFGE、WGS 或其他分子分型方法。对于培养基和微生物检验相关实验室而言，理解 PFGE 的原理和用途，有助于把传统培养分离结果与分子溯源分析更好地衔接起来。