沉降菌测试方法

沉降菌测试是洁净室、微生物实验室、食品和药品生产环境中常用的空气微生物监测方法之一。其基本原理是将装有适宜培养基的平皿暴露在规定位置和规定时间内，使空气中随尘埃、飞沫或气流沉降的活微生物落到培养基表面，经培养后形成菌落，再通过菌落数评价环境空气中可沉降微生物污染水平。

与浮游菌主动采样不同，沉降菌法不通过仪器抽取固定体积空气，而是依靠自然沉降。因此，沉降菌结果通常以“CFU/皿”或“CFU/皿·时间”表示，更适合用于环境趋势监测、洁净区操作状态评价和人员活动影响观察，不宜直接换算为空气中 CFU/m³。

一、测试前准备

沉降菌测试前，应根据洁净区级别、房间面积、关键操作点、人员活动路线、气流方向和风险评估结果确定采样点。采样点应覆盖产品暴露区、人员操作区、物料转移区、关键设备附近及历史监测异常位置。

测试用培养皿应提前制备或使用成品培养皿。采样前应检查培养皿外观，确认无污染、无破损、无干裂、无明显冷凝水、无培养基脱水收缩或气泡异常。发现培养基变质、皿盖破裂、平皿污染或表面水分异常时，应剔除不用。

进入洁净区前，应对培养皿外包装或平皿外表面进行适当清洁消毒。需要强调的是，不能对培养基表面消毒，否则会影响微生物沉降和恢复生长，导致结果失真。

二、培养基选择

沉降菌测试常用培养基包括大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）和沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）。TSA 营养较全面，适合多数需氧细菌及部分真菌生长，常用于环境中细菌总数监测；SDA 更适合霉菌和酵母菌培养，常用于环境真菌监测。

如果检测区域存在消毒剂残留干扰，或采样对象为经常消毒的洁净环境，可根据验证结果选择含中和剂的培养基，以降低消毒剂残留对微生物恢复的影响。培养基每批使用前应进行必要的质量检查，包括外观、无菌性和促生长能力。

三、测试步骤

测试时，将已制备好的培养皿按照采样点布置图逐个放置。放置顺序宜从洁净级别高、操作核心区域向外部区域进行，尽量减少人员移动对采样点的干扰。放置完成后，再按规定顺序打开皿盖，使培养基表面暴露于空气中。

暴露时间应符合检测标准或企业环境监测方案。静态测试通常可暴露不少于 30 min；动态测试时，因生产操作持续进行，可根据监测目的适当延长，但一般不宜超过 4 h。暴露时间过长时，培养基表面容易干燥，影响微生物恢复，也可能导致菌落融合，影响计数准确性。若需要长时间监测，可采用分时段更换培养皿的方式。

采样结束后，应及时盖好培养皿，做好标识，记录采样点、采样日期、暴露时间、培养基类型、洁净状态、人员和生产活动情况等信息。培养皿应倒置放入培养箱，按规定条件培养。

四、培养条件

采用 TSA 培养基的沉降菌平皿，常用于细菌监测，可在 30～35℃条件下培养，培养时间一般不少于 2 d。采用 SDA 培养基的平皿，常用于霉菌和酵母菌监测，可在 20～25℃条件下培养，培养时间一般不少于 5 d。具体培养温度和培养时间应以适用标准、企业验证方案或产品说明书为准。

每批培养基应设置对照培养，以确认培养基本身无污染。通常可从同批培养基中选取若干未暴露平皿作为阴性对照，与采样平皿同步培养。若对照平皿出现菌落，应调查培养基污染、运输污染或操作污染，并评估该批沉降菌结果是否有效。

五、菌落计数方法

培养结束后，用肉眼直接计数培养皿上的所有菌落。计数时可在平皿背面标记，或使用菌落计数器逐个点计。计数后可用 5～10 倍放大镜复核，检查是否遗漏边缘、小菌落或颜色较浅的菌落。

若平板上有 2 个或 2 个以上菌落重叠，但仍能分辨为独立菌落，应分别计数。若菌落融合、霉菌蔓延或覆盖面积过大，导致无法准确区分单个菌落，应按异常结果记录，并根据程序判断是否需要重新采样。

计数时应注意区分真正菌落与培养基沉淀、气泡、纤维、灰尘颗粒或培养基色斑。必要时可通过显微镜观察或转接培养进行确认。培养皿边缘生长的菌落也应仔细检查，避免漏计。

六、结果记录与表示

沉降菌测试结果通常记录为每个采样点的菌落数，单位可表示为 CFU/皿，必要时注明暴露时间，如 CFU/皿·30 min 或 CFU/皿·4 h。记录中应包括采样区域、采样点编号、培养基类型、暴露时间、培养条件、菌落数、异常情况和操作者信息。

沉降菌结果应结合洁净区级别、生产状态和历史趋势进行分析。单次结果异常可能与人员活动、开门频次、操作扰动、培养皿污染、培养基状态或真实环境污染有关。对于洁净区环境监测，更应关注趋势变化，而不是只看单点数据。

七、注意事项

沉降菌测试用具应经过灭菌或符合无菌要求，培养皿转运、摆放、开盖和回收过程中应尽量避免人为污染。操作人员动作应缓慢、规范，避免在培养皿上方说话、挥手、快速移动或频繁经过采样点。

采样过程中应保持采样点状态稳定。动态测试应尽量反映真实生产或操作状态，但不能因采样操作本身显著改变原有气流和人员活动。采样时如发生培养皿碰倒、皿盖落地、培养基表面被触碰或明显污染，应作废并记录。

培养后计数时，应仔细观察培养皿正面和背面，避免漏计边缘菌落、小菌落和颜色较浅的菌落。对于霉菌平皿，应注意培养时间过长可能导致菌丝扩展，影响其他菌落计数，因此应按规定时间观察并记录。

八、沉降菌法的优点与局限

沉降菌法操作简单、成本低、无需复杂仪器，适合长期、连续的环境趋势监测。它能较好反映一定时间内空气中可沉降微生物对开放产品、操作台面或暴露区域的污染风险，因此在洁净室环境监测中应用广泛。

但沉降菌法也有局限。它依赖自然沉降，受空气流速、粒子大小、人员活动、暴露时间、平皿位置和气流组织影响较大；同时不能测定单位体积空气中的微生物浓度，也不适合替代浮游菌主动采样。对于洁净环境评价，沉降菌、浮游菌、表面微生物、悬浮粒子、压差和温湿度等指标应结合分析。

九、常见问题分析

若沉降菌结果偏高，应排查人员操作、洁净服穿戴、开门频次、清洁消毒效果、空调系统、物料转运和培养皿暴露污染等因素。若多个点同时升高，可能提示区域性空气或人员控制问题；若单点反复升高，则应重点检查该点附近设备、气流死角、操作习惯或清洁盲区。

若沉降菌结果长期为零，也不一定代表环境完全无微生物。可能与暴露时间过短、培养基过干、消毒剂残留、培养条件不适、采样点选择不合理或方法灵敏度不足有关。应结合浮游菌和表面微生物结果综合判断。

若平皿菌落蔓延严重，可能与霉菌污染、培养基表面过湿、暴露时间过长或培养条件不当有关。应优化培养皿状态、暴露时间和培养观察时间。

十、小结

沉降菌测试是一种经典、简便的空气微生物监测方法，适用于评价洁净环境中可沉降微生物污染水平。其关键控制点包括培养皿质量、采样点布置、暴露时间、无菌操作、培养条件、菌落计数和结果趋势分析。

在实际应用中，沉降菌法不能替代浮游菌法，也不能直接反映单位体积空气中的微生物数量。它更适合作为环境监测体系的一部分，与浮游菌、表面微生物和洁净环境参数共同使用，才能更全面地评价洁净区微生物污染控制水平。