乳与乳制品中嗜冷性微生物检测方法

乳与乳制品中常说的“嗜冷菌”，更严谨地说应为嗜冷性微生物或低温生长微生物。它们并不一定是只能在低温下生长的严格嗜冷菌，而是指能在冷藏温度下缓慢生长，并可能影响乳品质量的一类微生物。原料乳、巴氏杀菌乳和冷藏乳制品中若存在较高数量的嗜冷性微生物，可能导致蛋白分解、脂肪分解、异味、苦味、凝块、黏稠或货架期缩短。

在乳品质量控制中，嗜冷性微生物检测常用于评价原料乳冷藏卫生状况、挤奶和贮奶环节污染控制、巴氏杀菌后再污染风险以及低温贮藏过程中微生物增长趋势。传统方法包括 6.5℃培养10天的基准法，以及21℃培养25 h的快速估算法。前者更接近低温贮藏条件下的实际生长能力评价，后者用于快速获得估算结果，但两者不能简单等同。

一、检测原理

嗜冷性微生物检测通常采用平板菌落计数法。将乳样按规定方法进行十倍系列稀释，取适当稀释度样液加入灭菌平皿，再倾注冷却至约46℃的培养基，使样品与培养基充分混匀。培养基凝固后，在规定温度下培养，使能在该条件下生长的微生物形成可见菌落。根据菌落数、稀释倍数和接种体积，计算每毫升样品中的菌落形成单位，结果通常表示为 CFU/mL。

6.5℃培养10天的方法属于低温长时间培养，能更好反映微生物在冷藏条件下的生长能力。21℃培养25 h的方法培养时间短，适合快速估算原料乳和巴氏杀菌乳中嗜冷性微生物水平，但并非所有能在6.5℃形成菌落的微生物都能在21℃、25 h内形成可计数菌落，因此快速法结果应作为估算值使用。

二、两种方法的区别

标准沿革上，早期 IDF 101A:1991 对应6.5℃培养方法，后续 ISO 6730 | IDF 101:2005 已被撤销并由 ISO 17410 替代；ISO 8552 | IDF 132:2004 描述21℃快速法，也已被 ISO 17410:2019 替代。实际检测时，应以企业当前采用的有效标准、客户要求或法规要求为准。

三、培养基与稀释液

检测常用培养基为平板计数琼脂，并加入脱脂奶粉。典型配制思路为：平板计数琼脂23.5 g，脱脂奶粉1 g，加水至1000 mL，必要时过滤，调节 pH 至6.9±0.1。脱脂奶粉应不含抑菌剂，否则可能影响低水平或受损微生物的恢复。

培养基分装后通常在121℃±1℃灭菌15 min。若灭菌后立即使用，应置于46℃±1℃水浴中保温；若暂不使用，使用前需重新熔化并冷却至46℃±1℃。培养基反复熔化会造成营养成分变化、水分损失和凝胶性能下降，应尽量减少重复加热次数。

稀释液可使用灭菌0.85%氯化钠溶液，也可根据实验室采用的标准方法使用其他经验证的稀释液。稀释液应无菌、无抑菌性，温度不宜过高或过低，以免影响菌体活性。

四、仪器与器具要求

检测需要常规微生物实验室设备，包括培养箱、pH计、水浴锅、灭菌三角瓶、吸管或移液器、无菌培养皿和菌落计数器等。6.5℃基准法要求培养箱能稳定维持6.5℃±0.5℃；21℃快速法要求培养箱能稳定维持21℃±1℃。低温培养周期长，培养箱温度波动会直接影响菌落形成，因此应定期校准和监控。

原文中提到“用嘴吸的吸管要用脱脂棉或纤维素塞紧”，这一表述应修正。现代微生物实验室不应采用口吸移液，应使用机械移液器、移液管助吸器或自动分液装置，以减少人员暴露和样品污染风险。

培养皿可使用直径90～100 mm的无菌玻璃或塑料平皿。平皿应无菌、干燥、无变形、无裂纹。培养皿堆叠培养时不宜过高，每叠平皿之间以及与培养箱内壁之间应留有间隙，保证温度均匀。

五、样品稀释

检测前应将乳样充分混匀，但应避免剧烈振荡产生过多泡沫。常用初始稀释方式为取25 mL样品加入225 mL灭菌稀释液中，充分混匀，制成1:10稀释液。也可采用10 mL样品加入90 mL稀释液，或11 mL样品加入99 mL稀释液的方式。样品和稀释液用量越大，通常有利于提高取样代表性。

随后按十倍递增稀释。每进行一次稀释，应更换无菌吸管或吸头，避免高浓度样液带入低浓度稀释液造成误差。稀释时应沿管壁加入样液，并充分混匀，使菌体分布尽可能均匀。

根据样品污染水平预估，选择2～3个适宜稀释度进行平板计数。每个稀释度通常做两个平行平皿，以提高结果可靠性。

六、倾注平板与培养

每个平皿中加入1 mL相应稀释液后，应尽快倾注约15 mL冷却至46℃左右的培养基。培养基温度过高可能损伤微生物，温度过低则容易提前凝固，影响样液与培养基混匀。倾注后轻轻转动平皿，使样液与培养基均匀混合，避免形成气泡或局部样液集中。

从样品稀释到倾注培养基，整个过程应尽量控制在15 min内完成。操作时间过长可能导致菌体沉降、损伤或增殖，从而影响计数准确性。

培养基凝固后，将平板倒置培养。基准法在6.5℃条件下培养10天；快速法在21℃条件下培养25 h。培养过程中应避免频繁开关培养箱门，以减少温度波动。

七、菌落计数

培养结束后，在柔和光线下进行菌落计数。可使用菌落计数器、放大镜或适当照明辅助观察，避免遗漏极小菌落，也要避免把培养基颗粒、乳中杂质、气泡或沉淀误认为菌落。

若平板上有大片状扩散菌落，一般不宜采用该平板计数，应选择同一稀释度中无片状菌落或受影响较小的平板。若片状菌落不到平板面积的一半，且另一半菌落分布均匀，可计数未受影响的一半平板后乘以2，作为该平板估算菌落数。

若出现链状菌落且菌落之间无明显界限，通常一条连续链可视为一个菌落；若可判断为不同来源的多条链，则每条链分别计数。对于难以判断的可疑点，应借助放大镜或显微镜确认。

八、计数平板的选择与结果计算

通常选择菌落数在10～300之间的平板作为计数依据。若两个连续稀释度的平板菌落数均在10～300之间，可按加权公式计算每毫升样品中的菌落数：

N = ΣC /〔（n1 + 0.1n2）d〕

其中，N为每毫升样品中的菌落数；ΣC为所有被计数平板菌落数之和；n1为第一个稀释度被计数平板数；n2为第二个稀释度被计数平板数；d为第一个被计数稀释度对应的稀释因子。

例如，第一个稀释度10^-2的两个平板菌落数为168和215，第二个稀释度10^-3的两个平板菌落数为14和25，则：

ΣC = 168 + 215 + 14 + 25 = 422
n1 = 2，n2 = 2，d = 10^-2
N = 422 /〔（2 + 0.1×2）×10^-2〕
N = 422 / 0.022 = 19182 CFU/mL

结果保留两位有效数字，可报告为1.9×10^4 CFU/mL。

若有三个连续稀释度均可计数，可扩展为：

N = ΣC /〔（n1 + 0.1n2 + 0.01n3）d〕

若所有平板菌落数均小于10，可按最低稀释度平板平均菌落数乘以稀释倍数，报告为估计值。若所有平板菌落数均超过300，可按最高稀释度平板平均菌落数乘以稀释倍数，报告为估计值，并在报告中注明估算性质。

九、质量控制要点

嗜冷性微生物检测周期较长，低温培养对培养箱稳定性要求高。实验室应定期确认培养箱温度分布和温度记录，尤其是6.5℃培养10天的方法，温度偏差可能导致部分微生物生长不足或结果偏低。

培养基质量也很关键。平板计数琼脂加脱脂奶粉应保证无菌、pH合格、凝胶状态良好、无抑菌成分。每批培养基应设置空白对照，确认培养基本身无污染。必要时应使用已知菌株或环境分离株进行促生长能力确认。

乳样本身含有脂肪、蛋白质和微小颗粒，计数时易与小菌落混淆。因此操作人员应熟悉乳品平板的典型背景特征，必要时通过复核或挑取可疑菌落进一步确认。

十、检测结果的意义

嗜冷性微生物数量高，通常提示原料乳冷藏时间过长、冷却不及时、挤奶设备或贮奶罐清洗消毒不足、生产用水或环境污染、巴氏杀菌后再污染等问题。部分嗜冷性微生物，尤其是假单胞菌等，可产生耐热蛋白酶和脂肪酶，即使后续热处理杀灭了菌体，酶仍可能残留并造成乳制品风味和稳定性问题。

因此，嗜冷性微生物检测不仅是一个计数项目，也是一项过程卫生指标。它可帮助企业判断冷链管理、原料乳周转、设备清洁和生产环境控制是否有效。

十一、小结

乳与乳制品中嗜冷性微生物检测常用平板菌落计数法。6.5℃培养10天的方法更适合评价低温条件下的实际生长能力，可作为基准计数思路；21℃培养25 h的方法出结果快，适合快速估算，但不能完全替代基准法。

检测的关键控制点包括样品充分混匀、准确十倍稀释、培养基温度控制、低温培养箱稳定性、合适计数平板选择和结果规范计算。对于乳品企业而言，嗜冷性微生物检测有助于识别冷藏污染风险、评价原料乳质量和延长乳制品货架期，是乳品微生物质量控制中不可忽视的项目。