LGG 益生菌的检测方法

LGG 是一种广泛应用于乳制品、益生菌制剂和功能食品中的益生菌菌株。其传统名称为 Lactobacillus rhamnosus GG，现行分类名为 Lacticaseibacillus rhamnosus GG，常对应菌株编号 ATCC 53103。LGG 具有革兰氏阳性、触酶阴性、杆状、常呈链状排列等乳酸菌典型特征。由于益生菌产品的功能价值与活菌数密切相关，因此对 LGG 纯菌种、发酵乳制品及复合益生菌产品中的 LGG 进行定量检测，是产品质量控制的重要内容。

需要注意的是，培养计数法检测的是“可培养活菌数”，结果受培养基、选择剂、样品基质、菌体损伤状态、厌氧条件和培养时间影响。若产品中存在其他万古霉素耐受乳酸菌，仅依靠 MRS-万古霉素琼脂计数并不能完全证明所有菌落均为 LGG，必要时应结合乳糖发酵特性、显微镜检查或分子鉴定方法确认。LGG 对万古霉素耐受性的研究已有报道，但这一特性并非 LGG 独有，因此只能作为选择性分离依据之一。

一、适用范围

LGG 检测方法适用于定量分析 LGG 纯菌种、含 LGG 的乳制品以及 LGG 与普通酸奶发酵菌混合产品中的 LGG 活菌数量。对于纯 LGG 菌粉或纯培养物，可使用普通 MRS 琼脂进行计数；对于含有嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌或其他乳酸菌的复合样品，则应采用具有一定选择性的培养基，如 MRS-万古霉素琼脂，并配合确认试验。

如果样品为多菌株益生菌产品，尤其含有其他鼠李糖乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌、植物乳植杆菌等万古霉素耐受乳酸菌时，培养法结果可能包含非 LGG 菌落。此时若需要报告“LGG 专属数量”，应采用菌株特异性 PCR、qPCR、活菌 qPCR 或其他分子方法辅助确认。近年来已有针对 LGG 的活菌实时 PCR 计数研究，用于提高菌株水平识别能力。

二、检测原理

样品经无菌稀释液稀释、均质后，按十倍系列稀释，选择适宜稀释度接种至 MRS 琼脂或 MRS-万古霉素琼脂中，在厌氧或低氧条件下培养。培养后选取菌落数适宜的平板进行计数，并根据接种体积和稀释倍数计算样品中 LGG 的菌落形成单位，结果以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。

MRS 培养基营养丰富，适合乳酸菌生长，但选择性有限。加入万古霉素后，可抑制部分非目标菌和普通酸奶发酵菌，从而提高 LGG 或相关耐万古霉素乳酸菌的检出选择性。由于 LGG 通常不发酵乳糖，可进一步通过乳糖发酵试验与部分乳糖发酵菌进行区分。

但选择性计数的本质是“筛选+确认”，不是单一平板直接定种。对乳制品中复杂菌群样品，应把菌落形态、乳糖发酵、革兰氏染色、触酶试验和必要的分子鉴定结合起来解释。

三、LGG 的典型特征

LGG 为革兰氏阳性杆菌，常呈单个、短链或长链排列；无芽胞；触酶阴性；在 MRS 类培养基上厌氧培养可形成较典型乳酸菌菌落。其菌落通常较大、光滑、白色至乳白色、圆形或椭圆形，边缘较清晰。

在乳糖发酵鉴别中，LGG 通常表现为不发酵乳糖，含乳糖和 pH 指示剂的鉴别肉汤中颜色一般不发生酸化变黄。而能够利用乳糖产酸的乳酸菌，则可使培养基 pH 下降，指示剂转为黄色。该特征可用于辅助区分 LGG 与部分酸奶发酵菌，但不能替代菌株水平鉴定。

四、主要仪器与耗材

LGG 检测需使用常规微生物实验室设备，包括高压蒸汽灭菌器、培养箱、水浴锅、均质器或拍击式均质器、天平、移液器、无菌塑料袋、无菌吸头、无菌培养皿和厌氧培养装置等。

培养箱温度应控制在 37℃±1℃。倾注法使用的琼脂培养基应冷却至 44～47℃，温度过高可能损伤 LGG 活菌，温度过低则容易提前凝固，影响样品与培养基混匀。厌氧培养可使用厌氧罐、厌氧产气袋和厌氧指示条，也可使用经验证的厌氧培养系统。

五、稀释液与培养基

常用稀释液可采用蛋白胨-氯化钠溶液。典型配方为蛋白胨1.0 g、氯化钠8.5 g、去离子水1000 mL。必要时可缓慢加热使其完全溶解，分装后于121℃±1℃灭菌15 min，灭菌后 pH 应为7.0±0.2。该稀释液可为菌体提供较温和的渗透压环境，减少稀释过程中菌体损伤。

MRS 琼脂适用于 LGG 纯菌种或背景菌较少样品的计数。灭菌后 pH 通常约为6.4±0.2，配制后应按说明书要求保存，避免反复熔化。

MRS-万古霉素琼脂适用于 LGG 与普通酸奶发酵菌混合样品的选择性计数。万古霉素常用浓度为50 mg/L。实际配制时，更推荐将万古霉素配制成无菌滤过溶液，在基础培养基灭菌并冷却至适宜温度后加入，混匀后倾注平板。若供应商说明允许灭菌前加入，也应经过培养基适用性验证，确认抗生素活性和目标菌回收率不受影响。

MRSL 肉汤可用于乳糖发酵特性确认。其核心是在 MRS 基础上加入乳糖和 pH 指示剂，观察菌株是否利用乳糖产酸。具体配方应按企业方法、标准方法或经验证的试剂说明执行。

六、样品制备

检测前，样品可在室温下平衡1～2 h，使样品温度接近室温。该步骤有助于改善称样均匀性，但不应导致样品长时间处于微生物可快速增殖的温度条件下。对于活菌产品，应避免高温、强光和长时间暴露。

称取10 g样品置于无菌塑料袋中，加入90 mL无菌蛋白胨-氯化钠稀释液，使用均质器混合约60 s，制成10^-1初始稀释液。若为液体样品，也可按1:10比例进行初始稀释。随后按十倍系列继续稀释。每次稀释应充分混匀，并更换无菌吸头或吸管，避免交叉带入。

从样品制备到平板接种应尽量控制在15 min内完成，以减少菌体沉降、损伤修复或增殖造成的计数偏差。

七、接种与培养

根据样品类型选择培养基。纯 LGG 菌种可选 MRS 琼脂；LGG 与普通酸奶菌种混合样品可选 MRS-万古霉素琼脂。根据预估菌数选择2～3个适宜稀释度，每个稀释度做两个平行平皿。

接种方式可采用倾注法或涂布法。倾注法通常取1 mL稀释液加入平皿，再加入44～47℃熔化琼脂并混匀；涂布法通常取0.1 mL稀释液涂布于预制平板表面。倾注法计数体积较大，适合菌数较低样品；涂布法对热损伤风险较小，更适合对热敏感或损伤菌较多的样品。

待琼脂凝固后，将平皿倒置放入厌氧罐。放入厌氧指示条和产气袋后，应立即密封厌氧罐，避免产气袋在空气中暴露过久影响除氧效果。平皿在37℃±1℃厌氧条件下培养72 h±6 h。

培养过程中应观察厌氧指示条变化。常见指示条在无氧状态下呈白色，有氧时呈粉色或其他颜色。若指示条显示厌氧状态未达标，应查找厌氧罐密封、产气袋有效性、装载量和操作过程问题，并按程序重新处理。

八、菌落计数

培养结束后，选择菌落数在10～300之间的平板进行计数。LGG 菌落通常表现为光滑、较大、白色或乳白色、圆形或椭圆形、边缘清晰。若平板上菌落过多、融合或背景菌干扰明显，应选择更高稀释度平板计数。

结果按以下思路计算：

LGG活菌数（CFU/g）= 平板平均菌落数 × 稀释倍数 ÷ 接种体积（mL）

若液体样品以体积取样，也可报告为 CFU/mL。报告时应注明培养基、培养条件和是否经过确认试验。对于含多种益生菌的样品，若未进行菌株特异性确认，不宜直接报告为“LGG 专属性活菌数”，应表述为“符合 LGG 筛选特征的乳酸菌计数”或按企业验证方法报告。

九、确认试验

为进一步确认菌落是否为 LGG，可从典型菌落中挑取若干个进行纯化，再开展显微镜观察、革兰氏染色、触酶试验和乳糖发酵试验。LGG 应表现为革兰氏阳性杆菌、触酶阴性，并在乳糖发酵鉴别肉汤中不产酸或不使指示剂转黄。

乳糖发酵试验可采用 MRSL 肉汤。接种纯化菌株后，在37℃±1℃培养1～2 d，观察颜色变化。LGG 不发酵乳糖时，培养基通常保持紫色或原始颜色；若菌株能利用乳糖产酸，培养基则变为黄色。试验时应设置纯 LGG 阳性对照和能够发酵乳糖的对照菌株，以确认培养基指示系统正常。

若产品标签宣称为特定 LGG 菌株，或检测结果用于菌株级质量评价，建议采用 LGG 特异性 PCR、qPCR、指纹图谱或测序等方法进一步确认。培养法适合活菌计数，但菌株特异性有限。

十、常见问题与原因分析

LGG 计数偏低，常见原因包括样品保存温度不当、菌体受冻融或氧暴露损伤、稀释液不适合、倾注琼脂温度过高、厌氧条件不足、培养时间不足或万古霉素浓度过高。对于益生菌粉剂，还要注意样品吸湿、结块和混合不均可能导致取样误差。

计数偏高或非目标菌干扰，常见于复合益生菌样品或发酵乳制品。由于部分乳酸菌也可能耐受万古霉素，MRS-V 平板上的菌落并不一定全部是 LGG。因此，菌落确认和选择性验证非常重要。

乳糖发酵结果不清晰，可能与接种量过低、培养时间不足、指示剂失效、MRSL 配方不当或菌株状态不佳有关。应同时设置阳性和阴性对照，并使用新鲜纯化菌落。

厌氧培养失败会明显影响乳酸菌生长。厌氧罐密封圈老化、产气袋失效、培养皿堆放过多、指示条贴壁或操作延迟，都可能导致厌氧状态不足。每次检测均应记录厌氧系统状态。

十一、质量控制要点

LGG 检测应建立完整的质量控制体系。稀释液应检查无菌性和 pH；MRS 和 MRS-V 培养基应检查外观、pH、无菌性、促生长能力和选择性；万古霉素母液应记录浓度、过滤除菌方式、保存条件和使用期限；厌氧系统应确认产气袋和指示条有效。

质控菌株应包括 LGG 或等效阳性菌株、可被万古霉素抑制的酸奶发酵菌，以及必要的乳糖发酵阳性对照菌。对于成品培养基或不同批次培养基，应通过回收率和典型菌落表现验证批间一致性。

十二、小结

LGG 益生菌检测的核心是通过样品稀释、选择性培养、厌氧培养和菌落计数，获得产品中的可培养活菌数。纯菌种可使用 MRS 琼脂计数；含普通酸奶菌或复合菌群的样品可使用 MRS-万古霉素琼脂进行选择性计数，并通过乳糖发酵、显微镜观察和必要的分子方法确认。

实际检测中，不能简单认为 MRS-V 上所有菌落都是 LGG。万古霉素耐受和不发酵乳糖只是筛选特征，菌株级确认仍需分子方法支持。对于益生菌乳制品和益生菌制剂企业而言，规范的 LGG 检测不仅用于标签活菌数控制，也关系到产品稳定性、货架期评价和质量一致性。