药典微生物项目变化的应对策略——菌种管理

菌种是药品微生物检验中最关键的“活体标准物质”。培养基适用性检查、方法适用性试验、阳性对照、抑菌效力检查、环境监测方法确认等工作，都离不开状态稳定、来源清晰、特性可靠的质控菌株。菌种一旦发生污染、退化、误用或传代失控，轻则导致试验失败，重则影响检验结果判断和质量决策。

从2015版《中国药典》开始，药品微生物实验室对菌种来源、传代、保藏、使用和销毁的管理要求明显强化。到现行药典体系中，菌种管理已经不只是“买来、复苏、接种”这么简单，而是一套覆盖全生命周期的质量管理系统。

一、检验用菌种的选择

药品微生物检验用菌种应来源明确、可追溯，并能证明其与标准菌株相关特性一致。通则9203《药品微生物实验室质量管理指导原则》中明确提出，药品微生物检验用试验菌应为有明确来源的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效、可以溯源的商业派生菌株；标准菌株应来自认可的国内或国外菌种保藏机构。

因此，菌种选择不应简单理解为“只能使用某一家菌种库”。CMCC、ATCC、NCTC、CICC 等菌种资源在不同标准、不同用途和不同监管背景下均可能被采用。关键是：具体检验方法是否规定了菌株编号；企业执行的是中国药典、出口国药典还是客户标准；所选菌株是否能提供来源证明、代次信息、特性说明和等效性依据。

对于完全按《中国药典》开展的微生物限度、无菌检查和培养基适用性检查，应优先使用药典方法列明的菌株编号或经确认等效的可溯源菌株。对于出口产品或多药典并行体系，则应在SOP中明确菌株选择依据，例如中国药典使用CMCC编号菌株，USP/EP/JP项目可使用ATCC、NCTC等对应菌株或商业派生菌株，并建立等效性和可追溯性文件。

二、常用药典质控菌株

药品微生物实验室常用菌株通常包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉等。这些菌株分别用于培养基促生长能力、选择性、无菌检查灵敏度、微生物计数、控制菌检查和方法适用性试验。

不同菌株的保藏、复苏和使用条件不同。细菌通常可采用营养丰富的非选择性培养基复苏；酵母菌和霉菌则更适合使用真菌培养基；厌氧菌需提供合适还原环境和厌氧培养条件；黑曲霉等产孢真菌还应重点控制孢子气溶胶污染风险。实验室不能用同一套操作条件粗放处理所有菌种。

三、菌种管理的基本流程

规范的菌种管理应覆盖申购、验收、确认、保藏、领用、复苏、传代、使用、记录和销毁全过程。每一支菌株都应具有唯一标识，并能追溯其来源、批号、代次、保存位置、保存条件、复苏记录和使用去向。

推荐管理流程如下：

菌株不是普通耗材，而是受生物安全和质量体系双重约束的材料。申购和领用应由指定人员管理，不能随意购买、转借或私自保存。

四、标准菌株、标准储备菌株与工作菌株

从菌种保藏机构获得的原始标准菌株通常作为第0代。该菌株复苏并在适宜培养基中生长后，可制备标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认，并采用适当方法长期保存。标准储备菌株再用于制备工作菌株，工作菌株用于日常试验。通则9203要求工作菌株传代次数应严格控制，不得超过5代，并明确从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代。

这一管理逻辑的目的，是减少反复传代导致的活力下降、特性漂移和污染风险。日常检验不应反复使用同一斜面无限传代，也不应把工作菌株重新作为标准储备菌株使用。商业派生菌株通常可作为工作菌株使用，但不能替代标准菌株建立无限延伸的菌种体系。

五、菌种保藏方法的选择

菌种保藏方法应根据菌种类型、实验室设备条件、使用频率和风险等级确定。常见方法包括甘油冷冻法、冻干法、液氮保藏、超低温冷冻、磁珠法和短期斜面保存等。

甘油冷冻法操作相对简单，适合许多细菌和酵母菌。常见做法是将复苏培养物与无菌甘油保护液混合，制成一定浓度甘油菌悬液，分装后置于低温条件保存。该方法的优点是每次使用一支，避免重复冻融和反复开管污染；缺点是需要可靠的低温设备。

冻干法和超低温保存更适合长期保藏。通则9203建议标准储备菌株可采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻等方法保存，并指出低于－70℃或低温冷冻干燥方法可延长菌种保存时间。

磁珠法使用方便，对设备要求相对低，适合部分实验室建立工作菌株体系。但同一管内多颗磁珠多次取用时，应特别注意无菌操作和污染控制。斜面低温保存操作简单，但需要定期转种，传代次数增加，污染和变异风险也随之增加，不宜作为长期主保藏方式。

六、不同菌种的保藏与复苏注意点

金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌等常见需氧细菌，通常复苏较容易，但仍应确认菌落形态、革兰氏染色和关键生化特性。枯草芽胞杆菌和其他芽胞菌还应关注芽胞形成状态，因为芽胞比例会影响菌悬液稳定性和接种量控制。

生孢梭菌属于厌氧菌，复苏和培养应保证还原环境和厌氧条件。若培养基氧化、厌氧系统不充分或操作暴露时间过长，可能导致复苏失败或生长不良。

白色念珠菌可作为酵母菌质控菌株，复苏时应注意培养时间和菌龄。老化培养物可能影响菌悬液均一性和计数准确性。

黑曲霉应重点防止孢子飞散。制备孢子悬液时，应尽量在生物安全柜中操作，避免剧烈振荡、吹打和干孢子暴露。孢子悬液可在验证后设定适当保存期限，以减少频繁制备带来的污染和人员暴露风险。

七、菌株确认：不能只看“长出来了”

菌株复苏后，不能只凭有菌落生长就直接入库使用。标准储备菌株应至少确认纯度和关键特性。常见确认项目包括菌落形态、显微形态、革兰氏染色、芽胞染色、氧化酶、触酶、生化鉴定、选择性培养基典型反应、真菌形态观察等。必要时可采用商品化鉴定系统、MALDI-TOF MS 或分子方法确认。

确认项目应与菌株用途匹配。例如用于培养基适用性检查的菌株，应重点确认其在对应培养基上的典型生长和反应；用于抑菌效力检查的菌株，应关注其生长活力和接种量可控性；用于控制菌检查的菌株，应关注选择性培养基上的典型菌落表现。

若发现菌株老化、退化、污染、特性异常或不再需要使用，应按程序灭菌销毁。通则9203也明确，标准菌株经确认已经老化、退化、变异、污染或无使用需要时，应及时灭菌销毁。

八、菌株使用中的交叉污染控制

菌株实验最容易被低估的风险之一是交叉污染。多个阳性菌株同时操作时，气溶胶、移液器、稀释液、枪头盒、台面、手套和培养皿外壁都可能成为污染媒介。即使操作者无菌技术熟练，也不应把不同菌株混在同一操作台面连续处理而不清场。

较稳妥的做法是不同菌株分时段操作，至少在两种菌株之间完成废弃物清理、台面消毒、生物安全柜运行净化和用品更换。用于A菌的稀释液、吸头盒、接种工具和记录用品，不应继续用于B菌。霉菌、芽胞菌、铜绿假单胞菌等更应严格控制操作区域和器具交叉使用。

对黑曲霉等易产生孢子气溶胶的菌株，应避免打开干燥成熟斜面后直接剧烈刮取。可先加入适量无菌稀释液湿润并覆盖菌落表面，再轻轻洗脱孢子，降低孢子飞散风险。操作完成后，应对生物安全柜、台面和废弃物进行充分消毒和灭菌处理。

九、接种量控制与菌悬液定量

药典微生物试验常要求低水平接种，例如10～100 CFU或50～100 CFU。接种量控制依赖稳定的菌株状态、固定培养条件、准确稀释操作和可靠的计数培养基。

实验室应固定每种菌株的复苏培养基、培养温度、培养时间、菌悬液制备方法和稀释倍数范围。不同人员的移液、混匀和稀释习惯会造成接种量差异，因此应通过培训和人员比对提高一致性。

计数培养基质量同样重要。若计数平板促生长能力不稳定，操作者可能误以为是自己稀释技术不合格。菌悬液定量体系应包括菌液制备、梯度稀释、接种、计数、回算和历史数据趋势分析。

对于黑曲霉孢子悬液、枯草芽胞杆菌芽胞悬液和生孢梭菌芽胞悬液，可通过验证建立一定保存期限。经验证的稳定菌悬液能减少重复制备工作量，提高接种量一致性，但应定期确认活菌数、纯度和典型性。

十、菌种生物安全管理

菌种管理不仅是质量管理问题，也是生物安全问题。药品微生物实验室涉及阳性菌操作时，应根据所操作微生物的危害等级、实验活动类型和法规要求，配置相应生物安全设施和管理制度。通则9203要求涉及生物安全的操作应符合相应国家、行业和地方标准规定，并要求实验室设立生物安全责任人、生物安全监督员等岗位。

GB 19489-2008《实验室 生物安全通用要求》是我国实验室生物安全的重要基础标准，该标准规定了不同生物安全防护级别实验室的设施、设备和安全管理基本要求；标准信息公共服务平台显示该标准于2009年7月1日实施，并在2026年复审结论为“修订”。

二级生物安全实验室适用于操作能够引起人类或动物疾病、但一般情况下对人、动物或环境不构成严重危害、传播风险有限的生物因子。 药品微生物实验室常用的某些阳性菌株，如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等，应按机构风险评估和相关法规要求在相应生物安全条件下操作。

生物安全管理应包括门禁管理、授权进入、专用设备、菌种台账、应急预案、溢洒处理、废弃物灭菌、人员培训、健康防护和年度风险评估。活菌培养物、菌悬液、接种平板和污染耗材均应作为感染性废弃物处理，不能与普通实验废弃物混放。

十一、菌种销毁与记录

菌种销毁应覆盖标准储备菌株、工作菌株、复苏培养物、菌悬液、梯度稀释液、接种平板、污染耗材和过期菌株。销毁通常采用高压蒸汽灭菌或经验证的化学消毒方法，销毁后应记录菌株名称、编号、代次、数量、销毁原因、销毁方式、执行人和复核人。

销毁不是简单“扔掉”。菌株是可繁殖的活体材料，任何未经灭菌的遗留、转移或丢弃都可能造成生物安全风险和质量体系漏洞。特别是阳性室、生物安全柜、培养箱、冰箱和废弃物暂存点，应定期核对，确保账物相符。

十二、菌种管理趋势

现代药品微生物实验室的菌种管理趋势，是减少不必要传代、提高商业化标准菌株使用比例、采用定量菌株或即用型质控材料、强化电子化追溯和生物安全风险评估。商品化定量菌株可提高接种量一致性，减少菌悬液制备工作量，但其供应商资质、菌株来源、赋值方法、运输条件和适用性仍需审计和确认。

对国内实验室而言，最现实的管理策略是建立稳定的标准储备菌株体系，并结合甘油冷冻、冻干、磁珠或超低温保存等方法，减少频繁传代；同时通过SOP固化复苏、确认、领用、稀释、使用和销毁流程。菌种管理应以可追溯、可复核、可解释为目标。

十三、小结

药典微生物项目变化对菌种管理提出的核心要求，是来源清楚、传代受控、保藏可靠、特性确认、使用规范和销毁可追溯。菌种不是普通试剂，而是会增殖、会变异、会污染、也可能带来生物安全风险的活体材料。

企业应建立从标准菌株到标准储备菌株、再到工作菌株的分级管理体系，严格控制工作菌株传代次数，规范申购、验收、确认、保藏、领用、使用和销毁全过程。只有菌种状态稳定，培养基适用性检查、方法适用性试验和阳性对照结果才有可信基础。对微生物实验室而言，菌种管理做得越前置、越规范，后续检验结果越稳定，偏差调查和生物安全风险也越可控。