霉菌检测中的注意事项

霉菌不是严格的分类学名称，而是一些能形成菌丝、孢子或绒毛状菌落的丝状真菌通称，属于真菌的一部分。食品中常见霉菌包括毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、镰刀菌属等。霉菌对人类具有双重影响：有益的一面是可用于酿造、发酵、酶制剂和抗生素生产；不利的一面是可导致食品、农副产品、原料和器材腐败变质，部分霉菌还可产生真菌毒素，如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素等，给食品安全带来风险。

食品霉菌检测的目的，通常是评价食品受霉菌污染的程度、判断储藏和加工卫生状况，并为产品保质期和风险控制提供依据。需要注意的是，霉菌检测不仅考验培养基性能，也非常依赖取样代表性、样品均质程度、孢子分散效果和培养判读经验。

一、霉菌检测为什么容易出现偏差

霉菌与细菌检测不同。细菌多以单细胞或短链状态存在，而霉菌常以菌丝团、孢子链、孢子团或碎片形式存在。若样品均质和稀释不充分，多个孢子或菌丝团可能形成一个菌落，导致计数偏低；若菌丝被剧烈打碎，也可能形成多个生长点，导致计数偏高。

霉菌孢子在空气中广泛存在，实验室环境、人员衣物、台面、培养皿暴露时间和操作动作都可能造成外源污染。因此，霉菌检测对无菌操作和环境控制要求较高。尤其是低菌量样品，少量空气污染就可能显著影响结果。

此外，不同霉菌生长速度差异较大。毛霉、根霉等蔓延性强，容易铺满平板；青霉、曲霉等菌落形态较典型，但某些菌株早期生长较慢。若培养时间、温度或观察时点控制不当，可能出现“未长出”“长成片”“不同稀释度结果接近”等问题。

二、取样代表性是第一关键

霉菌污染往往分布不均匀。粮食、坚果、糕点、调味品、干制食品和粉末样品中，霉菌可能集中在局部受潮、破损、结块或表面污染区域。如果取样量不足或只取外观较好部位，结果可能低估污染水平；若只取霉变明显部位，又可能高估整批产品风险。

因此，霉菌检测前应按产品类型和检验标准进行代表性取样。固体食品应从不同位置取样，必要时粉碎、混匀后再称样。液体或半流体样品应充分摇匀或搅拌均匀。对于分层、结块、含颗粒或油脂较多的样品，应采取合适的均质方法，使检测样品尽可能代表原始批次。

三、取样工具和容器必须无菌

霉菌孢子在空气中含量较高，取样工具、容器、剪刀、镊子、勺子、均质袋和稀释瓶均应经过灭菌处理。取样和称样过程中，应尽量缩短样品暴露时间，避免在空气流动较强、人员频繁走动或粉尘较多的区域操作。

取样容器应密封良好，避免运输过程中二次污染或水分变化。干制食品尤其要防止样品吸湿，因为水分升高可能促进霉菌恢复或生长，改变原始污染状态。若样品不能立即检测，应按标准或方法要求保存，避免长时间室温放置。

四、样品均质和孢子分散要充分

霉菌检测中，样品均质和稀释分散是影响计数准确性的核心步骤。由于霉菌孢子可能成链、成团或附着在食品颗粒表面，简单摇晃往往不能充分分散。样品加入稀释液后，应采用拍击式均质器、旋涡混合器或充分手工振摇，使孢子尽可能释放到液相中。

进行梯度稀释时，每一级稀释液都应充分混匀。使用无菌吸管或移液器转移前，应让液体中孢子分布均匀；必要时可反复吹吸数次，但要避免产生明显气溶胶。若未充分混匀，常会出现不同稀释度计数结果接近、平行样差异大、低稀释度反而菌落少等异常现象。

对含油、含糖、黏稠或粉末样品，应选择合适稀释液和均质方式。若样品难以分散，可按标准允许范围加入表面活性剂或采用预处理方法，但必须经过方法适用性验证，确认不会抑制目标霉菌生长。

五、培养基选择要匹配检测目的

霉菌检验常用培养基包括孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂、沙氏葡萄糖琼脂等。不同培养基的营养水平、pH、选择性和菌落表现不同，不能随意替换。

孟加拉红琼脂常用于食品中霉菌和酵母计数，孟加拉红可限制霉菌菌落过度扩散，便于计数。马铃薯葡萄糖琼脂营养较丰富，适合多种霉菌和酵母生长，也常用于真菌培养和保存。察氏琼脂更偏向于曲霉、青霉等真菌培养和形态观察。高盐察氏琼脂适合耐盐、嗜渗透压真菌检测，如某些低水分、高糖或高盐食品中的霉菌。

培养基选择应符合检测标准、样品类型和检验目的。若用于食品霉菌和酵母计数，应优先采用标准规定培养基。若用于分离纯化、形态鉴定或产毒菌研究，则可根据目标菌选择更适宜的培养基。

六、pH、抗生素和选择性成分要控制得当

霉菌和酵母培养基常通过偏酸性pH或抗生素抑制细菌生长。但选择性过强也可能抑制受损真菌，导致计数偏低。培养基pH过低、抗生素浓度过高、灭菌条件不当或贮存时间过长，均可能影响霉菌恢复和生长。

对于经热加工、干燥、冷冻、酸化或防腐剂处理的食品，霉菌可能处于损伤状态，若直接接种到选择性较强的培养基上，部分菌可能恢复不良。因此，检测方法应关注培养基促生长能力和适用性，必要时通过质控菌株和加标回收验证培养基性能。

七、培养温度和时间应按标准执行

霉菌和酵母通常适合在较低于多数细菌的温度下培养。食品霉菌和酵母计数常采用约28℃培养。GB 4789.15-2016中，相关设备要求包括28℃±1℃培养箱；该标准方法中培养至第5天观察记录结果，并选择适宜菌落数范围的平板计数。

原文中“25～28℃培养，3天后观察，需培养观察一周”的说法只能作为一般经验，不能替代标准要求。实际检验时，应按现行标准、产品标准或企业验证方法规定的温度和时间执行。日常操作可从第3天起观察菌落生长趋势，防止蔓延性霉菌覆盖全板，但最终计数应以规定培养终点为准。

八、计数时要区分霉菌和酵母

食品霉菌和酵母计数中，霉菌和酵母通常可根据菌落形态进行区分。霉菌菌落多呈绒毛状、棉絮状、粉末状或放射状，常有菌丝和孢子结构；酵母菌落多为圆形、湿润、光滑、乳白色或浅色，类似小型细菌菌落但通常较大、较厚。

计数时应选择菌落分布均匀、菌落数适宜、无明显蔓延覆盖的平板。若霉菌菌落过度扩散、覆盖整个平板或相互融合，应选择更高稀释度平板计数。若所有平板均无法准确计数，应按标准规定报告，并说明原因。

菌落形态不典型时，可进行显微镜观察。取少量菌落制片后观察菌丝、孢子、分生孢子头、孢囊、假菌丝或芽生细胞等结构，有助于区分霉菌、酵母和部分污染细菌。

九、常见问题及原因分析

不同稀释度计数结果相近，常见原因是样品未充分均质、孢子团未分散、稀释液混匀不足或吸样不均匀。霉菌孢子成团时，一个团块可能在多个稀释度中随机分布，导致计数不符合正常递减规律。

平板不生长或生长很少，可能与培养基不适宜、pH过低、抗生素或选择剂过强、样品中存在抑菌物质、培养温度不合适、培养时间不足或目标菌受损有关。此时应检查阳性对照、培养基批号、灭菌条件和培养箱温度。

平板生长过好、连成片无法计数，多见于稀释度选择过低、样品霉菌污染水平高、蔓延性霉菌较多、培养时间过长或培养基限制扩散能力不足。应选择更高稀释度，或使用更适合计数的培养基。

平行样差异大，常与称样不均、样品颗粒分布不均、均质不足、移液误差或平板表面水分过多有关。对粉末、颗粒、坚果、糕点和干制食品，应特别注意样品充分混匀。

空白对照出现霉菌，通常提示稀释液、培养基、平皿、吸管、操作环境或人员操作存在污染。霉菌孢子空气传播能力强，一旦空白污染，应谨慎判定本批结果。

十、霉菌检测中的生物安全与防污染

霉菌操作应避免产生大量孢子气溶胶。打开培养后的霉菌平板时动作要轻，避免吹气、剧烈振荡或长时间暴露。对疑似产毒霉菌或大量霉菌污染平板，应在生物安全柜中操作，并做好个人防护。

培养后的平板、吸头、稀释液和污染耗材应经高压蒸汽灭菌后处理。实验结束后应及时清洁消毒台面、培养箱和可能污染区域。霉菌孢子容易附着在培养箱内壁、台面缝隙和器具表面，若清洁不彻底，可能成为后续实验的污染源。

十一、小结

霉菌检测的准确性取决于取样代表性、无菌操作、样品均质、孢子分散、培养基选择、培养温度时间和计数判读等多个环节。霉菌孢子易成团、易空气传播、菌落易蔓延，是其检测中最容易造成偏差的原因。

实际检测中，应避免只凭经验判断，食品霉菌和酵母计数应按现行标准和经验证方法执行。对于异常结果，应从样品、稀释、培养基、培养条件和操作污染等方面系统排查。只有控制好前处理和培养判读细节，霉菌检测结果才具有可靠性和可比性。