致泻大肠埃希氏菌的分离与鉴定

致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）不是单一血清型或单一菌株，而是一类能够引起人体腹泻的大肠埃希氏菌。普通大肠埃希氏菌多为肠道正常菌群，但部分菌株获得特定毒力因子后，可通过污染食品引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征等疾病。GB 4789.6-2016 将常见致泻大肠埃希氏菌主要分为肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌和肠道集聚性大肠埃希氏菌。

食品中致泻大肠埃希氏菌检测的核心思路，是先通过增菌提高目标菌检出概率，再在选择性或鉴别性平板上分离可疑菌落，随后进行生化确认、血清学鉴定和毒力基因确认。需要注意的是，单靠麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂上的菌落形态，不能最终判定是否为致泻大肠埃希氏菌。

一、致泻大肠埃希氏菌的主要类型

致泻大肠埃希氏菌按致病机制可分为多个类型。不同类型的临床表现、毒力因子和检测靶标不同，因此检测时不能只依赖传统生化和血清学结果。

原文中主要强调血清学分型，这是旧版检测思路的重要部分。但现代检测更强调“生化确认 + 血清学辅助 + 毒力基因确认”。原因是同一血清群内可能既有致病株，也有非致病株；不同血清型也可能携带相同或相近毒力基因。因此，血清学阳性只能提示可疑，不能完全替代毒力因子确认。

二、样品增菌与选择性分离

食品样品中的致泻大肠埃希氏菌数量可能较低，且常伴随大量背景菌。样品经增菌后，可将增菌液划线接种于麦康凯琼脂或伊红美蓝琼脂平板，通常在36℃±1℃培养18～24 h后观察菌落。具体增菌液、培养条件和接种流程应按现行 GB 4789.6-2016 或实验室经验证方法执行，该标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法，适用于食品中该类菌的检验。

在麦康凯琼脂上，大多数典型大肠埃希氏菌可发酵乳糖产酸，形成粉红色至红色、圆形、湿润、边缘整齐的菌落。但部分致泻大肠埃希氏菌，尤其是EIEC，可能不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖，菌落可呈无色或浅色。因此，挑取可疑菌落时不能只选择深红色乳糖阳性菌落，也应结合标准要求挑取其他可疑菌落。

在伊红美蓝琼脂上，典型大肠埃希氏菌常形成紫黑色或紫红色、有黑色中心、有时带金属光泽的菌落。但金属光泽受菌株、培养基批次、培养时间、接种量和培养条件影响，并非所有大肠埃希氏菌都表现典型金属光泽。伊红美蓝琼脂主要用于初步分离和提示乳糖发酵特征，不能作为最终鉴定依据。

三、可疑菌落挑取原则

从选择性平板上挑取可疑菌落时，通常应选择多个形态不同或典型的单个菌落进行后续试验。原文中“挑取5～10个菌落”是合理思路，目的是提高检出概率，避免因只挑取单个菌落而漏检目标菌。

挑菌时应注意以下几点：第一，优先挑取分离良好的单个菌落，避免从融合区挑菌；第二，同时关注典型乳糖阳性和可疑乳糖阴性菌落；第三，每个菌落应分别接种，不应混合后再做生化；第四，可疑菌落应同步接种营养琼脂斜面或其他非选择性培养基保存，以便后续血清学和分子确认。

如果样品背景菌多、平板菌落过密或典型菌落不明显，应选择适当稀释度或重新分离纯化。没有纯培养物，后续生化和血清学结果容易出现混合反应，导致误判。

四、初步生化鉴定

可疑菌落通常可分别接种三糖铁琼脂、pH 7.2尿素琼脂和营养琼脂小斜面，36℃±1℃培养18～24 h后观察。三糖铁琼脂用于观察葡萄糖、乳糖或蔗糖发酵、产气和硫化氢产生；尿素琼脂用于排除尿素酶阳性菌；营养琼脂斜面用于获得纯培养菌苔，供后续生化、血清学和PCR试验使用。

典型大肠埃希氏菌在TSI中多表现为斜面和底层产酸，可产气，硫化氢阴性；尿素酶阴性。部分EIEC或其他非典型菌株可能表现为斜面不产酸、底层产酸，因此不应仅凭TSI斜面反应排除所有可疑菌。原文中“TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，硫化氢阴性和尿素阴性”的描述较符合筛选逻辑。

进一步生化鉴定中，大肠埃希氏菌通常氧化酶阴性、吲哚阳性、甲基红阳性、V-P阴性、枸橼酸盐阴性，乳糖发酵多为阳性，但不同致泻型别可出现变异。EIEC较特殊，常表现为赖氨酸脱羧酶阴性、动力阴性或弱动力，部分血清型如O124可动力阳性或阴性。GB 4789.6-2016也指出，EIEC无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖，生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。

五、常用培养基和试验的作用

六、血清学鉴定的意义与局限

血清学鉴定主要用于检测大肠埃希氏菌的O抗原和H抗原。旧版流程常先用多价O血清进行玻片凝集，若与某一多价血清凝集，再用该多价血清包含的单价O血清确认。若与某一单价O血清出现强凝集，可作为假定阳性结果。

进一步证实试验可制备O抗原悬液，与稀释后的O血清进行试管凝集，观察凝集结果。原文中提到将O抗原悬液稀释至相当于MacFarland 3号比浊管浓度，血清稀释后与抗原悬液等量混合，经一定温度和时间作用后观察凝集，这是传统血清学确认思路。

但血清学试验存在明显局限。第一，菌体表面K抗原或荚膜样结构可能影响O抗原凝集，需要按方法处理抗原。第二，粗糙型菌株可能自凝，造成假阳性。第三，血清群与致病性并非一一对应。第四，部分新发或少见致泻菌株可能不在常规血清覆盖范围内。因此，血清学结果应与生化结果和毒力基因检测综合判定。

七、PCR确认试验的重要性

GB 4789.6-2016 与旧版相比，一个重要变化是增加了PCR确认试验，并删除了肠毒素试验。 这反映了致泻大肠埃希氏菌检测思路的变化：确认重点从“血清型和毒素表型”逐步转向“毒力相关基因”。

不同致泻型别对应的关键基因不同。例如，ETEC通常关注热稳定性肠毒素和热不稳定性肠毒素相关基因；EIEC常关注侵袭性质粒相关基因，如ipaH等；STEC关注志贺毒素基因；EPEC关注黏附和擦拭性损伤相关基因；EAEC关注集聚黏附相关基因。GB 4789.6-2016中也明确提到EIEC侵入上皮细胞的关键基因包括ipaH、ipaR/invE等。

PCR确认的优势是特异性较强、速度较快、能直接提示致泻型别。但PCR也不能脱离分离培养。食品基质中存在抑制物、死菌DNA或混合菌时，结果解释需要谨慎。标准检验中应按规定流程进行增菌、分离、确认和结果报告。

八、不同型别的鉴定关注点

EPEC的重点是黏附和擦拭性损伤相关毒力特征，不产生志贺毒素。若菌株只具有普通大肠埃希氏菌生化特征而无相关毒力标志，不能判定为EPEC。

EIEC与志贺氏菌关系密切，常表现为无动力、赖氨酸脱羧酶阴性和乳糖阴性或迟缓发酵，容易在常规分离中被忽略。因此，检测EIEC时不能只挑取典型乳糖阳性大肠埃希氏菌样菌落。

ETEC主要通过产生肠毒素导致水样腹泻。旧方法中可能涉及肠毒素试验，但GB 4789.6-2016已删除肠毒素试验，转而采用更适合标准化的确认方法。

STEC/EHEC的核心风险在于志贺毒素。部分菌株，尤其是某些EHEC，可引起出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征。GB 4789.6-2016对STEC/EHEC的定义中也强调其可分泌志贺毒素，部分菌株可引起出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征。

EAEC则以集聚黏附为主要特征，常与持续性腹泻相关。其鉴定更依赖毒力基因或分子方法，单靠传统生化难以区分。

九、常见问题与纠正

只挑取典型金属光泽菌落，可能漏检。 EMB上典型大肠埃希氏菌可有金属光泽，但EIEC等致泻型别可能不典型。挑菌应覆盖典型和可疑菌落。

血清学阳性不等于致泻性确认。 O抗原或H抗原凝集只能说明抗原型别相符，不能证明一定携带致泻毒力因子。最终应结合PCR确认或标准规定的确认流程。

生化结果符合大肠埃希氏菌，不代表一定是致泻大肠埃希氏菌。 普通大肠埃希氏菌也可表现为氧化酶阴性、吲哚阳性、MR阳性、VP阴性。致泻性判断必须关注毒力特征。

混合菌会干扰凝集和PCR结果。 后续鉴定应使用纯培养物。若平板菌落不纯，应重新划线纯化。

尿素阳性、H₂S阳性或氧化酶阳性菌株一般不符合典型大肠埃希氏菌特征。 这类结果应考虑变形杆菌、沙门氏菌、弧菌、气单胞菌或其他非目标菌干扰，并按鉴定流程排除。

十、质量控制要点

致泻大肠埃希氏菌检测应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。培养基应验证促生长能力、选择性和指示性；PCR试验应设置阳性模板、阴性模板和空白对照；血清学试验应注意自凝控制。

培养温度、培养时间、接种量、挑菌数量和纯化步骤都应严格记录。对可疑结果，应保留纯培养物，便于复核、送检、分子分型或溯源分析。实验室还应防止阳性对照菌污染样品，尤其在PCR扩增区域，应严格分区操作，避免扩增产物污染。

十一、小结

致泻大肠埃希氏菌检测的关键，不是简单找到“大肠埃希氏菌”，而是确认其是否属于具有致泻毒力特征的菌株。传统流程中的麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、TSI、尿素、IMViC和血清学试验仍有重要价值，但它们主要用于分离、初筛和辅助鉴定。

现代标准更强调毒力基因确认。GB 4789.6-2016已在旧版基础上增加PCR确认试验，并调整血清学鉴定内容。实际检验中，应按现行标准完成增菌、分离、生化确认、血清学辅助和PCR确认，避免仅凭菌落颜色、乳糖发酵或O血清凝集结果作出最终结论。