培养基的使用：融化、脱氧、添加剂加入与平板储存要点

培养基是微生物检验的基础材料。即使配方正确、生产合格，如果实验室使用不当，也可能导致培养基性能下降，出现目标菌生长不良、选择性异常、菌落不典型、平板污染、计数偏差等问题。因此，培养基使用环节应和配制、灭菌、质量控制一样受到重视。

培养基使用通常包括琼脂培养基融化、冷却保温、必要时脱氧、添加热敏成分、平板制备、平板干燥、储存和使用前检查等步骤。每一步都可能影响培养基的促生长能力、选择性和指示性。食品微生物实验室应按 GB 4789.28-2024、相关检验方法标准、产品说明书和实验室内部SOP执行。

一、琼脂培养基的融化

商品化瓶装琼脂培养基、实验室灭菌后凝固的琼脂培养基或需重新融化使用的培养基，通常可采用沸水浴、蒸汽浴或其他等效方式融化。融化时应保证琼脂完全溶解，避免瓶底残留未融化胶块，否则倾注平板后会出现局部凝固不均、厚度不一或菌落分布异常。

经过高压灭菌的培养基再次融化时，应尽量缩短重新加热时间。过度加热会破坏营养成分、糖类、维生素、指示剂、选择剂和显色底物，含糖量高、含胆盐、染料、抗生素或显色底物的培养基尤其敏感。反复融化还会降低琼脂凝胶强度，使平板偏软、泌水或菌落扩散异常。

融化后不要立即剧烈摇晃或突然置于冷环境中。玻璃瓶在高温状态下存在热冲击风险，可短暂置于室温，使瓶内外温差缓和后再转移到恒温水浴中保温。操作时应佩戴隔热手套，避免瓶塞过紧导致压力异常。

二、融化后的冷却与保温

融化后的琼脂培养基通常应置于约47℃～50℃恒温水浴中冷却保温，直至使用。部分培养基凝固温度、成分稳定性或添加剂要求不同，可根据产品说明适当调整。倾注到样品中的培养基温度一般控制在约45℃，以减少对微生物的热损伤，同时又能保持琼脂处于液态。

保温时间不宜过长。原文中“融化后放置时间一般不应超过4 h”可作为一般控制要求，但实际应结合培养基类型和标准要求执行。对含糖、含血液、含卵黄、含抗生素、含显色底物、含亚碲酸盐或其他热敏物质的培养基，保温时间应尽量缩短。长时间保温可能导致选择性下降、指示剂褪色、pH变化、营养成分降解或污染风险增加。

未用完的融化培养基不应重新凝固后留待下次使用。这样做不仅增加污染风险，也会使培养基经历重复热处理，导致性能不可控。实验室应根据当天用量合理融化，减少剩余。

三、培养基脱氧

某些培养基在使用前需要脱氧或恢复还原状态，例如流体硫乙醇酸盐培养基、厌氧培养相关培养基以及部分还原性培养基。脱氧的目的，是去除溶解氧或降低氧化还原电位，为厌氧菌、微需氧菌或受氧敏感的微生物提供更合适的环境。

常见方法是在使用前将培养基置于沸水浴或蒸汽浴中加热约15 min，加热时适当松开容器盖，使溶解氧逸出；加热后立即盖紧，并迅速冷却至使用温度。需要注意的是，脱氧过程不能过度加热，也不能长时间敞口放置，否则冷却过程中又会重新吸收氧气。

对含氧化还原指示剂的培养基，如含刃天青的培养基，应观察颜色变化。若培养基上部明显氧化且超出产品说明允许范围，应按说明重新处理或弃用。厌氧相关培养基的“外观看起来正常”并不等于还原状态一定合格，必要时应结合质控菌株验证。

四、添加成分的加入

许多培养基需要在基础培养基灭菌、冷却后加入热不稳定成分，如抗生素、卵黄、血液、亚碲酸盐、维生素、显色底物、选择性添加剂或特定底物。添加温度是关键控制点。温度过高会导致添加剂失活、蛋白变性或显色底物降解；温度过低则琼脂开始凝固，添加剂不易均匀分散，平板间差异增大。

通常应在培养基冷却至约47℃～50℃时加入无菌添加剂。无菌添加剂使用前应恢复至室温，避免冷液体加入后造成局部琼脂凝结、片状物或絮状物。加入后应缓慢、充分混匀，避免剧烈摇晃产生气泡。含卵黄和血液的培养基更应轻柔混合，以减少泡沫、絮凝和溶血样变化。

添加剂用量必须准确。选择剂过量可能抑制目标菌，导致假阴性或生长率偏低；选择剂不足则背景菌抑制不良，影响分离和判读。显色底物、指示剂、卵黄或血液加量不当，也会造成颜色、沉淀环、透明圈或溶血反应不典型。

五、平板制备

倾注平板时，应将融化并混匀的培养基倒入无菌平皿，使培养基形成均匀厚度。对于直径90 mm的平皿，通常加入18 mL～20 mL琼脂培养基，可形成约3 mm厚度的平板。平板过薄容易干燥，影响菌落大小和选择剂浓度表现；平板过厚则可能影响扩散反应、耗材成本和培养基冷却速度。

平板倾注后应置于水平平面自然凝固，避免移动造成表面波纹、厚薄不均或气泡集中。凝固后应检查平板外观，包括颜色、透明度、气泡、裂纹、析水、污染、厚度和表面平整度。对含沉淀性组分或卵黄成分的培养基，应确认添加剂分布均匀。

如果平板需要储存，或培养时间较长、培养温度较高，可适当增加培养基量，以减少干燥造成的结果偏差。但增加培养基量也可能影响某些扩散性反应，因此应按标准或产品说明执行。

六、平板标识与记录

平板制备后应及时标识。标记内容通常包括培养基名称、批号或配制批号、制备日期、有效期、添加剂名称或批号、制备人员等。标记应写在平皿底部或侧边，不宜只写在皿盖上，因为皿盖容易混淆。

实验室也可采用培养基编码系统管理。对于批量制备平板，应建立制备记录，包括干粉批号、称量量、配制体积、灭菌条件、最终pH、添加剂批号、倾注数量、外观检查、无菌检查和性能测试结果。培养基记录应能追溯到每一次检验使用的具体批次。

七、平板储存

凝固后的平板可立即使用，也可按要求储存。多数平板应避光、低温、密封保存，通常可置于5℃±3℃冰箱中。含染料、显色底物、抗生素、血液、卵黄、亚碲酸盐等成分的培养基更应注意避光和温度控制。

平板应冷却后再装入密封袋或包装袋中，以减少冷凝水产生。若热平板直接封袋冷藏，袋内水汽容易凝结在平板表面，导致接种时菌液扩散、菌落融合或局部稀释选择剂。储存前通常不建议对平板表面进行干燥处理，因为提前干燥会缩短平板可用期，并可能改变培养基表面状态。

储存期应按标准、产品说明或实验室验证结果确定。不同培养基稳定性差异很大，不能用一个固定期限覆盖所有平板。高选择性平板、含抗生素平板、显色平板和血平板通常比普通营养琼脂更敏感，使用前应重点检查外观和质控表现。

八、使用前的平板干燥

对于表面接种、涂布、划线分离或药敏相关操作，平板表面应适度干燥。表面水分过多会导致菌液流动、菌落融合、抑菌圈异常或典型菌落不清晰。常用干燥方式包括将平板倒置或半开盖置于洁净环境、培养箱或无菌净化台中，使表面水滴消失。

干燥温度不宜过高，时间不宜过长。原文中提到可在25℃～50℃条件下干燥，应结合培养基类型控制。过度干燥会导致培养基表面收缩、开裂、选择剂浓缩、pH变化和菌落变小。含易挥发成分、抗生素或显色底物的培养基更应避免长时间高温干燥。

商品化预制平板应按厂家说明使用。部分商品平板已完成适宜表面状态控制，使用前只需恢复至室温；若自行额外干燥，反而可能影响性能。

九、使用前检查

培养基使用前应进行外观检查和必要的性能确认。外观检查包括是否污染、变色、浑浊、沉淀异常、干裂、析水过多、气泡过多、平板过薄或标签不清。液体培养基还应检查是否有絮状物、浑浊、沉淀、产气或颜色异常。

性能确认包括无菌性、促生长能力、选择性和指示性。GB 4789.28-2024 作为食品微生物学检验用培养基和试剂质量控制标准，增加了参比培养基质控标准、性能测试方法流程图及测试菌株信息等内容，强调培养基使用前后应通过适当质控确认其性能。

若培养基外观异常或质控菌株表现不符合要求，不应继续用于样品检测。对已用于检测的异常批次，应评估对已出具结果的影响，必要时启动偏差调查。

十、不同类型培养基的使用注意事项

十一、常见问题及原因分析

平板表面水分过多，常由平板未冷却即封袋、冷藏后未平衡至室温、培养箱温差大或储存湿度高引起。表面水分会造成菌液扩散和菌落融合。

平板过干或开裂，常由储存时间过长、包装不严、干燥过度或培养温度过高导致。过干平板会影响菌落大小、典型反应和回收率。

培养基颜色变深，可能与过度加热、反复融化、糖类焦化、pH变化或指示剂降解有关。含糖培养基尤其需要控制灭菌和融化条件。

添加剂出现絮状物，常见于基础培养基温度过高导致卵黄、血液或蛋白类成分变性，或温度过低导致琼脂局部凝固。添加剂未恢复室温也可能造成局部片状凝胶。

目标菌生长差，可能与培养基热损伤、选择剂过量、pH异常、保温过久、平板过干或添加剂失活有关。应通过质控菌株排查培养基性能。

杂菌抑制不足，可能与选择剂添加不足、抗生素失效、保温时间过长或储存条件不当有关。对选择性培养基，应重点检查添加剂批号和保存条件。

十二、小结

培养基的使用质量直接影响微生物检验结果。琼脂培养基融化时应避免过度加热和反复融化；融化后应在适宜温度下短时间保温；热敏添加剂应在培养基冷却到合适温度后加入；平板制备应保证厚度均匀、标识清楚、储存规范；使用前应检查外观、干湿度和质控性能。

培养基不是“融化后能倒板”就合格。真正合格的培养基，应在使用状态下仍能稳定表现出促生长能力、选择性和指示性。实验室应将融化、保温、添加、储存和使用前检查全部纳入质量控制，才能保证微生物检测结果准确、可靠、可追溯。