培养基的实验室制备：从水质、称量到灭菌与质控

培养基制备是微生物检验最基础、也最容易被低估的环节。培养基配方正确，并不代表最终使用状态一定合格。水质不符合要求、称量误差、溶解不充分、pH调整不当、灭菌过度、添加剂失活或分装污染，都可能导致目标菌生长不良、选择性异常、菌落不典型、计数偏差甚至假阴性。

食品微生物实验室制备培养基时，应按照现行标准、产品说明书和实验室SOP执行。GB 4789.28-2024 规定了食品微生物学检验用培养基和试剂的质量要求，适用于培养基和试剂的质量控制；GB 4789.2-2022 等具体检验方法也会规定相应培养基、试剂和操作条件。

一、一般要求：按说明制备，按记录追溯

实验室制备培养基主要有两种方式：一是使用商品化脱水培养基，按说明书加水、溶解、调pH、灭菌和分装；二是使用蛋白胨、浸粉、糖类、盐类、琼脂、指示剂、选择剂等基础原料自行配制。无论采用哪种方式，都必须保证配制过程可追溯。

使用商品化脱水培养基时，应严格按生产厂商说明操作，包括称量量、加水体积、溶解方式、pH要求、灭菌条件、添加剂加入方式和储存条件。不能随意改变浓度、灭菌时间或添加剂用量。部分培养基对加热敏感，错误灭菌会明显影响选择性和指示性。

实验室自配培养基时，应记录培养基名称、配方、每种成分用量、试剂级别、生产商、批号、配制体积、分装体积、pH、灭菌方式、灭菌温度和时间、制备日期、制备人员、复核人员以及后续质控结果。记录的目的不是形式留档，而是当出现菌落异常、质控失败或客户投诉时，能追溯问题来源。

二、水质是培养基制备的基础

培养基制备用水应符合实验方法或标准要求。旧版资料中常要求实验用水在25℃时电导率不超过25 μS/cm，相当于电阻率不低于0.4 MΩ·cm；同时应定期检查微生物污染水平。实际应用中，实验室应按现行标准、设备能力和内部质量控制要求确认水质。

水中若含有过多离子、有机物、余氯、重金属或微生物污染，可能影响培养基pH、透明度、凝固性和微生物生长。对某些选择性培养基、显色培养基和低营养培养基而言，水质差异甚至会造成明显的批间差异。

实验室应建立制水系统维护和监测制度，包括电导率、微生物限度、设备清洗、滤芯更换、储水容器消毒和取水点管理。制备关键培养基或低营养培养基时，更应关注水质稳定性。

三、称量与溶解：避免结块和局部浓度不均

称量前应检查脱水培养基或原料是否在有效期内，瓶盖是否密封，粉末是否吸潮、结块、变色或有异味。干粉培养基含有胆盐、染料、抗生素、亚碲酸盐或其他选择剂时，称量应避免吸入粉尘，必要时佩戴口罩或在通风柜中操作。

称量应使用经过校准或核查的天平，称量量应与配制体积匹配。称量后先加入部分水，充分分散，再补足至规定体积。直接将粉末倒入全量水中，容易形成团块，导致局部不溶和成分分布不均。

含琼脂培养基在加热前可先浸泡几分钟，使琼脂充分吸水，有助于后续溶解。加热过程中应连续或间歇搅拌，避免瓶底结焦、局部过热或泡沫溢出。含糖量高的培养基尤其要避免长时间强烈加热，以免糖类焦化或发生褐变反应。

四、pH测定与调整

pH是影响培养基性能的重要指标。过酸或过碱都会影响目标菌生长、选择剂活性、指示剂变色范围和菌落典型性。一般情况下，培养基最终pH应在标准规定值的允许范围内，常见要求为灭菌后冷却至25℃时达到目标pH±0.2，但具体应以产品说明和标准方法为准。

pH测定应使用经校准的pH计。含琼脂培养基测pH时，应在完全溶解、混匀并处于适宜温度状态下取样测定。若需调整pH，常用约1 mol/L氢氧化钠溶液或约1 mol/L盐酸溶液少量多次加入，边加边混匀，避免局部过酸或过碱。

有些培养基灭菌后pH会发生变化，因此不能只看灭菌前pH。若标准要求灭菌后pH，实验室应以灭菌后成品状态为准。若需灭菌后调整pH，应使用无菌或经除菌过滤的酸碱溶液，并在无菌条件下操作。

五、分装：容器容量和装量要合理

配制好的培养基应分装到适合的容器中，如耐热玻璃瓶、试管、三角瓶、培养基制备器或其他经验证容器。容器容量应大于培养基装量，通常至少预留20%以上空间，以防高压灭菌时沸腾、溢出或爆瓶。

分装前应充分混匀，尤其是含琼脂、沉淀性成分、染料或不易溶组分的培养基。若分装过程中培养基逐渐冷却，应注意保持均匀状态，避免前后瓶浓度不同。试管斜面、半固体管和液体管的装量应符合用途要求，过多或过少都会影响灭菌、观察和结果判读。

分装容器应清洁、无残留、无裂纹，瓶盖或塞子应适合高压灭菌。灭菌时瓶盖通常不宜完全拧死，以免压力异常；灭菌后应按SOP及时拧紧或封闭，防止二次污染。

六、灭菌方式：湿热灭菌与过滤除菌

培养基常用灭菌方式包括湿热灭菌和过滤除菌。选择哪种方式，应取决于培养基成分的耐热性和标准要求。

湿热灭菌通常在高压蒸汽灭菌器或培养基制备器中进行。常见条件为121℃、15 min左右，但并非所有培养基都适用这一条件。具体温度和时间应按检验标准、产品说明书或方法验证结果执行。灭菌不足会导致污染，灭菌过度则会破坏营养成分和选择性成分。

部分培养基不能高压灭菌。例如亚硒酸盐类、含煌绿或含其他热敏成分的培养基，可能要求煮沸处理后迅速冷却并避光保存。这里应注意，煮沸处理不是严格意义上的灭菌，而是特定标准或产品说明允许的制备处理方式。不能将“煮沸”随意用于需要灭菌的普通培养基。

过滤除菌适用于热不稳定溶液，如抗生素、维生素、糖溶液、某些选择剂、酶底物和血清类成分。通常使用0.22 μm或相近孔径的无菌滤膜，具体孔径和材质应按试剂性质选择。过滤前应确认滤膜与溶剂、抗生素或蛋白成分相容，必要时可用无菌水或相应溶剂预润湿滤膜。

七、灭菌过程中的关键控制

灭菌效果不仅由设定温度和时间决定，还受装量、容器形状、装载方式、冷空气排除、蒸汽穿透和冷却速度影响。大体积培养基升温和降温较慢，容易出现“中心未充分灭菌”或“实际受热过度”的问题。因此，单瓶培养基体积不宜过大，大容量培养基应使用经验证的培养基制备器或灭菌程序。

对含糖、含染料、含选择剂或指示剂的培养基，灭菌后应尽快采用适当方式冷却，避免长时间处于高温状态。含煌绿、胆盐、糖类、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等成分的培养基对热处理更敏感，过度加热可能造成颜色异常、沉淀增加、选择性改变或目标菌生长率下降。

灭菌器应定期进行温度、压力和时间确认。生物指示剂、化学指示剂和温度记录可用于验证灭菌过程，但培养基本身还需通过无菌检查和性能测试确认是否适合使用。

八、灭菌后检查：外观、pH、无菌性和均匀度

培养基灭菌或过滤除菌后，应进行基本检查。检查内容包括外观、颜色、透明度、沉淀、凝固性、pH、无菌性、分装量和均匀度。含琼脂培养基应确认凝固正常；液体培养基应无异常浑浊、絮状物、产气或沉淀变化。

颜色异常可能提示过度加热、pH偏移、指示剂降解或原料质量问题。沉淀异常可能与水质、盐类反应、pH变化或灭菌条件有关。琼脂凝固不良可能由琼脂质量、浓度不足、酸水解、反复加热或灭菌过度造成。

无菌检查是培养基放行的重要环节。若未接种培养基在规定条件下出现浑浊、菌落或颜色变化，应判定存在污染风险，不得用于样品检测。

九、添加成分的制备和使用

许多培养基需要单独制备添加剂，如抗生素溶液、卵黄乳液、亚碲酸钾溶液、血液、维生素、糖溶液、显色底物或其他选择性成分。添加剂制备应按说明书进行，注意溶剂、浓度、除菌方式、保存温度和有效期。

抗生素和其他有生物活性的粉末可能引起过敏或刺激，称量时应避免粉尘扩散，必要时在通风柜中操作。抗生素工作液原则上现用现配；如需批量配制，应分装后低温保存，避免反复冻融。解冻后的抗生素溶液一般不应再次冷冻。

不要使用过期添加剂。添加剂过期、反复冻融、受热或受光照后，活性可能下降，导致选择性不足；也可能发生降解，影响目标菌生长或显色反应。每批添加剂使用前后应结合培养基质控结果确认其有效性。

十、添加剂加入培养基的注意事项

热敏添加剂应在基础培养基灭菌后冷却至合适温度时加入，通常约45℃～50℃。温度过高会使抗生素失活、卵黄或血液变性、显色底物降解；温度过低则琼脂开始凝固，添加剂分散不均，导致平板间差异。

添加剂加入前应恢复至室温，避免冷液体造成局部琼脂凝结或形成片状物。加入后应缓慢充分混匀，避免剧烈震荡造成气泡、泡沫或蛋白成分析出。含卵黄、血液和乳液类添加剂的培养基，应特别注意混匀方式和倾注时间。

添加剂用量应准确。选择剂过量会抑制目标菌，选择剂不足会使背景菌生长过多；显色底物或指示剂用量不准，则会造成颜色偏浅、假阳性或典型反应不清晰。

十一、实验室自制培养基的性能验证

培养基制备完成后，不能只凭外观判断合格。用于食品微生物检验的培养基，应根据其用途进行性能测试。非选择性培养基重点验证促生长能力；选择性培养基应同时验证目标菌生长和非目标菌抑制；鉴别培养基应验证典型反应；计数培养基应关注回收率和菌落形态。

GB 4789.28-2024 相比2013版有较大调整，明确了培养基和试剂质量控制要求，并增加了参比培养基质控、培养基评价方法和相关测试内容。 实验室使用商品化培养基或自制培养基时，都应结合标准要求和内部质控体系进行验收或确认。

质控菌株应来源明确、传代受控、纯度和典型性确认。测试结果不合格的培养基不得用于样品检验；已经使用的，应评估对检测结果的影响并按偏差程序处理。

十二、常见质量问题及原因分析

十三、制备记录和追溯管理

实验室应建立完整的培养基制备台账。每批培养基至少应记录名称、配方、制备日期、批号、配制量、分装量、pH、灭菌条件、添加剂信息、外观检查、无菌检查、性能测试结果、有效期和储存条件。

记录应真实、及时、完整，不应事后凭记忆补写。培养基标签应与记录一致，避免只在瓶盖上标记。对预制平板、试管培养基、液体培养基和添加剂，应建立库存管理，按先进先出原则使用，并定期检查有效期和储存状态。

十四、小结

培养基实验室制备的核心是“准确配方、正确处理、充分验证”。水质、称量、溶解、pH、分装、灭菌、过滤除菌、添加剂加入和性能测试，每一步都会影响最终检测结果。

制备培养基不能只追求“能凝固、能长菌”，而应确保其在实际使用状态下具备稳定的促生长能力、选择性和指示性。对食品微生物实验室而言，培养基制备过程的规范化和可追溯管理，是保证检验结果准确、可靠和可复核的基础。