乳制品微生物检验时的注意事项

乳制品营养丰富，含有蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质和水分，是微生物容易生长的食品类型。原料奶、巴氏杀菌乳、发酵乳、奶粉、灭菌乳、调制乳和奶酪等产品的微生物风险不同，检验方法和注意事项也不完全相同。乳制品微生物检验不仅要关注菌落总数、大肠菌群、霉菌酵母和商业无菌，也要结合产品类型、加工方式、包装状态和异常表现进行综合判断。

乳制品检验的关键，是防止二次污染、保证样品代表性、严格控制培养条件，并按现行标准进行结果判读。旧资料中的部分操作经验仍有参考价值，但不能替代现行GB 4789系列标准、产品标准和实验室经验证方法。

一、微生物实验室的基本要求

乳制品微生物实验室应保持清洁、干燥、易清洁、易消毒，墙面、台面和地面应尽量平整、耐腐蚀、无积尘死角。实验区应按功能合理划分，通常包括样品接收区、样品前处理区、无菌操作区、培养区、培养基和器具准备区、清洗灭菌区、阳性菌操作区和废弃物处理区。不同区域应避免交叉污染，尤其要防止阳性对照菌、污染样品和待检样品之间相互影响。

原文中“工作室要矮小”表述不准确，现代实验室更强调空间布局合理、气流组织稳定、清洁消毒方便、人员物流清晰，而不是单纯追求房间小。无菌操作区可采用洁净工作台、生物安全柜或符合要求的洁净环境。进行致病菌、阳性菌或高污染样品操作时，应根据生物安全风险选择合适的生物安全柜和防护措施。

实验室采光、照明和观察条件应满足操作要求。室内外观察窗可用于管理，但不是无菌保障的核心。真正影响检验质量的是环境清洁、空气控制、人员行为、消毒程序和操作规范。

二、无菌室或无菌操作区使用注意事项

无菌操作区应保持物品最少化，只放置本次操作必须使用的器具、培养基、稀释液和记录用品。与本次实验无关的物品不应进入操作区，避免增加尘埃、气流扰动和污染源。

操作前应清洁并消毒台面、移液器、样品外包装和所需器具。紫外灯可作为辅助消毒手段，但不能替代擦拭消毒和规范清洁。紫外线存在照射死角，对有机物覆盖表面作用有限，并且对人员眼睛和皮肤有伤害，使用时应避免人员暴露。

原文提到每2周用消毒液擦拭、喷雾或熏蒸，这类频率不能作为固定要求。实际应根据实验室使用频率、污染风险、环境监测结果和内部SOP确定清洁消毒频次。高频使用的无菌操作台面，通常应在每次操作前后消毒；培养箱、冰箱、传递窗、地面和墙面则按计划清洁并记录。

无菌操作时应少说话、动作轻、减少手臂跨越开放培养皿或样品容器，尽量缩短培养皿和瓶口暴露时间。人员进入无菌操作区域前，应穿戴洁净工作服、帽子、口罩和手套，必要时进行二次更衣和手消毒。

三、培养基配制注意事项

乳制品微生物检验常用培养基包括平板计数琼脂、VRBA或VRBGA、大肠菌群相关培养基、孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、沙氏葡萄糖琼脂、Baird-Parker琼脂、MYP琼脂、TCBS琼脂、商业无菌检验用培养基等。不同培养基的灭菌、pH、添加剂和储存要求不同，应按产品说明书和标准执行。

培养基灭菌时应严格控制温度和时间。过度灭菌会破坏糖类、维生素、指示剂、选择剂和琼脂凝胶性能，导致培养基颜色变深、pH偏移、选择性异常或目标菌生长不良。含糖培养基、显色培养基、抗生素培养基和卵黄培养基尤其应避免反复加热。

培养基不宜二次高压灭菌。已经灭菌并凝固的琼脂培养基，如需融化使用，应控制融化次数和保温时间；未用完的融化培养基通常不应重新凝固后留待下次使用。培养基配制应避免使用可能释放金属离子或发生反应的容器，现代实验室通常使用符合要求的玻璃容器、不锈钢设备或专用培养基制备器，而不是铜锅、铁锅等器具。

用于表面接种的平板，应在使用前使表面适度干燥。平板表面水分过多会造成菌液流动、菌落融合、计数偏差和典型反应不清晰；但过度干燥也会导致菌落变小、选择剂浓缩和回收率下降。

四、无菌操作关键点

乳制品样品通常脂肪、蛋白和糖分较多，样品前处理和稀释过程容易产生残留和交叉污染。操作时应做到“一样一器具、一稀释度一吸管或枪头”，避免用同一吸管跨稀释度操作。

接种环、接种针使用前后应灭菌，灭菌后必须冷却再接触菌体或培养基，避免高温杀死目标菌。使用吸管时不得口吸，应使用移液器、吸球或电动助吸器。样品瓶口、试管口和培养皿应尽量减少敞开时间。

工作结束后，应对操作台面、移液器外表面和可能污染区域进行终末消毒。所有培养物、污染吸头、稀释液、培养皿和样品残液均应经高压蒸汽灭菌或按实验室生物安全程序处理后再废弃。

五、菌落总数测定注意事项

菌落总数测定是乳制品质量控制中最基础的指标之一。GB 4789.2-2022规定了食品中菌落总数测定方法，适用于食品中菌落总数的测定。 乳制品检测时，应根据样品状态选择合适的均质和稀释方式。液体乳应充分混匀；固体或半固体乳制品应从多个部位取样，避免只取表面或局部区域。

连续稀释时，每一级稀释液都应充分振摇或混匀，使微生物均匀分散。每一稀释度应更换无菌吸管或枪头，防止高浓度样液带入低浓度稀释管。吸样时避免吸管尖端接触非目标表面，也不要让液体外壁污染稀释管口。

倾注法中，熔化琼脂培养基应冷却至适宜温度后使用。原文“46±10℃”明显不严谨，应修正为约46℃左右或按标准规定温度执行。温度过高会损伤乳制品中的受损菌，温度过低则琼脂易凝固，影响混匀和菌落分布。样品加入平皿后应尽快倾注培养基并旋转混匀，一般不应长时间放置。

计数时应选择菌落数适宜、分布均匀、无明显蔓延和污染的平板。链状菌落若无明显分界且来源连续，可按一个菌落计；若为不同来源的链状生长，应分别计数。最终报告应按标准规定的计数范围、稀释倍数和计算规则执行。

六、大肠菌群检验注意事项

大肠菌群是乳制品卫生状况的重要指示指标。其检出常提示原料、设备、水源、人员操作或杀菌后污染存在问题。GB 4789.3-2025规定了食品中大肠菌群计数方法，并将代替GB 4789.3-2016；GB 4789.3-2016的废止日期为2025年9月16日。

乳糖胆盐管等产气结果观察时，应按标准判定气泡或产气情况，不能把培养基振摇产生的机械气泡误判为产气。若倒管中有稳定气体形成，通常提示发酵产气可疑；若气泡瞬间消失或仅附着管壁，应谨慎判断。

在伊红美蓝琼脂或其他分离平板上挑取菌落时，应挑取典型和可疑菌落进行后续确认。乳制品中背景菌复杂，不能只凭菌落颜色直接判定大肠菌群或大肠埃希氏菌。阳性结果应结合发酵、分离、确认和计数规则综合判断。

七、霉菌和酵母检验注意事项

霉菌和酵母常见于奶粉、干酪、发酵乳、含果粒乳制品、乳饮料、甜炼乳和污染后的包装产品中。GB 4789.15-2016规定了食品中霉菌和酵母计数方法，其中第一法适用于各类食品中霉菌和酵母计数，第二法适用于番茄酱罐头、番茄汁中霉菌计数。

样品稀释液应按标准选择，不宜简单统一写成“无菌水”。对于含蛋白、脂肪、糖分或较黏稠的乳制品，应选择能充分分散样品且不抑制霉菌酵母恢复的稀释体系。稀释和接种时要充分混匀，因为霉菌孢子和菌丝碎片容易成团，混匀不足会导致平行结果差异大。

霉菌培养皿不应随意打开。霉菌孢子容易气溶胶化并污染实验室环境，培养后观察应尽量减少开盖操作。若需挑取或镜检，应在合适防护条件下进行。培养结束的霉菌平板应高压灭菌后再清洗或废弃。

八、坏包、酸包和胀包分析注意事项

乳制品“坏包”分析包括胀包、酸包、漏包、沉淀、凝块、异味、变色、分层等异常情况。坏包分析的重点不是单纯培养微生物，而是结合包装状态、pH、感官、理化指标和微生物结果判断异常来源。

未开封异常包应先进行外包装消毒，再在无菌条件下开包取样。已开封样品存在二次污染风险，其结果只能作为参考，不能完全代表原包装内状态。若已开包酸包或胀包需要分析，应尽快转移至无菌容器并记录开封时间、保存条件和可能污染风险。

不同异常表现应选择不同检测项目。胀包应关注产气菌、酵母、肠杆菌科、梭菌和商业无菌；酸包应关注乳酸菌、大肠菌群、pH变化和滴定酸度；腐败臭味可关注蛋白分解菌、假单胞菌、芽胞菌；脂肪水解味则应关注脂肪酶产生菌和原料奶嗜冷菌风险。

九、商业无菌检验注意事项

商业无菌主要用于经热杀菌并密封包装、要求常温储存的食品。GB 4789.26-2013规定了食品商业无菌检验的基本要求、操作程序和结果判定，适用于食品商业无菌的检验。 商业无菌并不表示绝对无菌，而是指在通常储存条件下，不含致病性微生物，也不含能在其中繁殖并导致腐败的非致病性微生物。

乳制品商业无菌检验应结合保温观察、包装状态、pH、感官、镜检和培养结果综合判定。若产品在保温期间出现胀包、漏包、pH显著变化、凝块、异味、腐败变质或镜检发现异常数量细菌，应进一步进行划线培养和污染菌鉴定。

需要厌氧培养的样品必须在厌氧条件下培养。若只做需氧培养，可能漏检厌氧芽胞菌或兼性厌氧污染菌。对可疑样品，应与同批正常样品比较pH、感官和镜检结果，判断是否存在明显微生物增殖。

十、环境和空白对照

乳制品微生物检验应设置必要的空白对照和环境监测，但不宜机械理解为“每次对所有灭菌物品都做空白对照”。更合理的做法是按检验项目和实验室SOP，对稀释液、培养基、器具批次、操作环境和关键步骤设置阴性对照或空白控制。

超净工作台或生物安全柜应按计划进行沉降菌、浮游菌或表面监测。高风险操作、阳性结果频发或环境异常时，应增加监测频次。若空白对照出现菌落，应暂停相关批次结果判定，排查培养基、稀释液、器具、环境和人员操作污染。

十一、常见问题及原因分析

十二、小结

乳制品微生物检验的准确性，取决于实验室环境、样品代表性、无菌操作、培养基质量、培养条件、计数规则和结果复核。菌落总数、大肠菌群、霉菌酵母、坏包分析和商业无菌检验各有重点，不能用同一种操作思路处理所有乳制品样品。

实际工作中，应按现行GB 4789系列标准和企业验证方法执行，避免沿用过时或不严谨的经验表述。对异常结果，应结合产品类型、包装状态、pH、感官、镜检、培养和污染菌鉴定进行系统分析。只有把检验操作和质量控制细节稳定下来，乳制品微生物检测结果才具有可靠性和可追溯性。