微生物的培养：影响因素与常用培养方法

微生物培养是微生物检验、菌种保藏、培养基研发和微生物鉴定中的基础技术。所谓培养，是指在人工控制的营养、温度、pH、水分、氧气和时间等条件下，使微生物生长、繁殖或表现特定生理生化特征。不同微生物的遗传特性不同，对外界环境的要求也不同，因此没有一种培养条件适用于所有微生物。

在实际工作中，培养条件设置是否合理，直接影响目标菌能否恢复、生长是否旺盛、菌落是否典型、计数是否准确以及鉴定结果是否可靠。培养基只是微生物培养的基础，温度、氧气、水分活度、pH、接种量和培养方式同样关键。

一、营养物浓度对微生物生长的影响

微生物生长需要碳源、氮源、无机盐、水分和生长因子等营养物质。营养充足时，微生物可进行细胞合成和能量代谢；营养不足时，生长速度下降，甚至进入休眠或死亡状态。

细菌比生长速率与限制性营养物浓度之间常可用 Monod 方程近似描述：

μ = μmax × S / (Ks + S)

其中，μ 为比生长速率，μmax 为最大比生长速率，S 为限制性营养物浓度，Ks 为半饱和常数。该公式说明：当营养物浓度较低时，营养物增加会明显提高生长速率；当营养物浓度较高时，生长速率逐渐接近最大值，再继续增加营养物，促进作用有限。

Ks 值越小，说明该微生物在低营养环境下利用底物的能力越强。许多环境微生物能在低营养条件下长期生存，与其高效底物利用能力有关。但营养物并非越多越好，过高的糖、盐或蛋白胨浓度可能造成渗透压升高、pH变化、代谢副产物积累，反而抑制微生物生长。

二、温度：决定生长速度和代谢状态

每种微生物都有自己的生长温度范围，通常包括最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度三个关键点。低于最低生长温度时，微生物一般不能生长，但可能存活；高于最高生长温度时，细胞蛋白、膜结构和酶系统受损，微生物停止生长，严重时死亡。最适生长温度下，微生物代谢活跃，生长速度最快，代时最短。

按最适生长温度不同，微生物通常可分为以下几类：

原文中“嗜冷微生物最适生长温度多数在-10℃～20℃之间”的说法过宽。更准确地说，严格嗜冷微生物的最适生长温度较低，而食品冷藏中常见的多为嗜冷性或耐冷微生物，它们能在冷藏温度下生长，但最适温度未必很低。

三、水分与水分活度

水是微生物生命活动的基本条件。营养物质溶解、酶促反应、细胞代谢、物质转运和孢子萌发都离不开水。但影响微生物生长的不是食品中水分总量，而是水分活度，即微生物可利用水的程度。

不同微生物对水分活度要求不同。一般而言，细菌要求较高，酵母次之，霉菌较低。多数细菌在低水分活度食品中不能生长，但仍可能存活较长时间。霉菌和耐渗透压酵母可在较低水分活度环境中缓慢生长，因此干果、糕点、果酱、肉干、奶粉和香辛料等低水分或中湿食品仍需关注霉菌、酵母或耐干燥病原菌风险。

原文中“微生物不能脱离水而生存”应理解为不能脱离水进行正常生长繁殖。部分芽胞、孢子和干燥耐受性较强的微生物可在低水分状态下长期存活，一旦环境复水，仍可能恢复生长。

四、pH对微生物培养的影响

pH会影响微生物细胞膜稳定性、酶活性、营养物质转运和代谢产物形态。多数细菌适宜在中性至弱碱性条件下生长，霉菌和酵母通常对酸性环境耐受性更强。因此，酸性食品中细菌风险相对下降，但霉菌、酵母和耐酸菌仍可能造成腐败。

培养基pH应根据目标菌要求设置。例如，大多数常规细菌培养基pH接近中性；乳酸菌培养基常偏酸；弧菌类培养基常偏弱碱；霉菌酵母培养基可偏酸。培养基灭菌后pH可能发生变化，因此制备培养基时应关注最终pH，而不是只看配制前pH。

五、氧气需求：五类微生物的区别

氧气是影响微生物培养方式的重要因素。按对氧气的需求和耐受性，微生物可分为需氧、兼性厌氧、微需氧、耐氧厌氧和专性厌氧五类。

需氧微生物需要氧气作为呼吸代谢的电子受体，无氧条件下不能正常生长。例如铜绿假单胞菌等典型需氧菌在有氧条件下生长良好。需要注意的是，高于空气氧浓度的高氧环境对部分需氧菌也可能产生氧化胁迫。

兼性厌氧微生物在有氧和无氧条件下都能生长。有氧时多进行呼吸代谢，无氧时可进行发酵或厌氧呼吸。大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌等均可表现出兼性厌氧特征。原文中的“兼性需氧微生物”更准确应称为兼性厌氧微生物。

微需氧微生物需要氧气，但最适氧浓度低于空气中的氧浓度，常还需要一定二氧化碳。弯曲菌、幽门螺杆菌等属于典型微需氧菌。原文中“在0.2大气压下生长最好”不准确，因为空气中氧分压约为0.21个大气压，微需氧菌通常需要低于空气氧浓度的环境。

耐氧厌氧微生物不利用氧气进行生长，但能耐受氧气存在，不会被空气中的氧迅速杀死。某些乳酸菌属于此类或接近此类。

专性厌氧微生物不能在有氧条件下生长，氧气对其有抑制甚至杀灭作用。梭菌、拟杆菌等许多厌氧菌需要严格厌氧培养条件。其对氧敏感，主要与缺乏完善的活性氧清除系统有关。

六、好氧培养方法

好氧培养适用于需氧菌和兼性厌氧菌，是实验室最常用的培养方式。固体平板、斜面、液体静置培养和摇瓶培养均可用于好氧培养。

斜面培养通过棉塞、透气盖或松盖方式与外界空气交换，可用于纯培养、菌种短期保存和扩大培养。液体培养若需要较高溶氧，可采用摇床振荡、通气培养或浅层装液方式。三角瓶摇床培养时，装液量、摇床转速、瓶型、通气塞和培养温度都会影响溶氧水平。

好氧培养时应注意平板倒置培养，减少冷凝水滴落造成菌落蔓延；培养箱内平板不宜堆叠过多，以免影响温度均一性和空气流通。

七、厌氧培养方法

厌氧培养的核心是降低氧化还原电位并排除或消耗氧气。常用方法包括使用还原性培养基、厌氧罐、厌氧袋、厌氧培养箱、抽气换气法和气体置换法。

降低培养基氧化还原电位是培养厌氧菌的重要措施。常用还原剂包括硫乙醇酸盐、L-半胱氨酸、谷胱甘肽等。流体硫乙醇酸盐培养基就是利用还原剂和少量琼脂降低氧扩散，形成适合厌氧菌或微需氧菌生长的环境。

化学除氧可通过焦性没食子酸、专用厌氧产气包或氢气与催化剂反应等方式消耗氧气。传统焦性没食子酸法有一定历史意义，但现代实验室更常使用商品化厌氧产气袋、厌氧罐或厌氧工作站。

隔绝阻氧可通过深层液体培养、石蜡油封层、半固体穿刺培养等方式减少氧气进入。半固体穿刺不仅可观察厌氧菌生长，也可用于动力试验。

气体置换是用氮气、二氧化碳、氢气或混合气体置换空气，建立厌氧或低氧环境。严格厌氧菌培养时，应使用厌氧指示剂确认环境是否达标。

需要修正的是，原文中“硫基醋酸盐”应为“硫乙醇酸盐”，“二氧气碳”应为“二氧化碳”。

八、微需氧和CO₂培养

微需氧培养适用于弯曲菌、幽门螺杆菌等需要低氧环境的微生物。常用微需氧环境可由微需氧产气袋、气调罐或专用培养箱提供。其关键不是完全去除氧气，而是将氧气降低到适宜范围，同时提供适量二氧化碳。

CO₂培养与微需氧培养不同。CO₂培养主要提供较高二氧化碳浓度，常用于某些链球菌、奈瑟菌和嗜血杆菌等；而微需氧培养则要求氧浓度低于空气水平。两者不能混淆。

九、按培养基物理状态分类的培养方法

按培养基物理状态，微生物培养可分为固体培养、半固体培养和液体培养。

固体培养是在琼脂等凝固剂形成的固体培养基表面或内部培养微生物，常用于分离纯化、菌落形态观察、菌落计数和选择性分离。平板划线、涂布和倾注均属于常见固体培养方式。

半固体培养使用低浓度琼脂形成弱凝胶体系，常用于动力试验、厌氧环境维持、运送培养和某些保存用途。运动性细菌可沿穿刺线向周围扩散生长，无动力菌通常仅沿穿刺线生长。

液体培养可使微生物快速繁殖，常用于增菌、复苏、菌液制备、发酵培养和生化试验。液体培养可观察浑浊、沉淀、菌膜、絮状生长、产气和颜色变化，但不能直接形成单菌落，因此通常不能替代固体分离纯化。

十、培养条件的综合控制

实际培养中，温度、营养、pH、水分和氧气不是孤立因素。例如，选择性培养基中的胆盐、染料、抗生素或高盐本身会对细胞造成压力；若同时温度偏高、pH偏离或培养基过干，目标菌可能生长不良。受损菌尤其容易受到多重压力影响，因此食品和药品样品检测中常需要复苏或预增菌步骤。

培养条件还应与检测目的匹配。用于计数时，应让目标菌形成清晰、可数的菌落；用于分离时，应使目标菌与背景菌区分明显；用于鉴定时，应保证生化反应充分而不过度；用于保藏时，则应尽量降低代谢速度并保持菌株特性稳定。

十一、常见培养问题及原因

十二、小结

微生物培养是根据目标微生物的生理特性，提供适宜营养、温度、水分、pH和气体环境的过程。营养物浓度决定生长潜力，温度决定代谢速度，水分活度决定可利用水，pH影响酶活和细胞稳定性，氧气条件决定培养方式。

实验室应根据目标菌选择好氧、厌氧、微需氧或CO₂培养方式，并结合固体、半固体或液体培养基完成分离、计数、增菌、复苏或鉴定。培养不是简单地“放进培养箱”，而是对微生物生长条件的系统控制。只有培养条件设置正确，微生物检验和培养基质量评价结果才可靠。