产气荚膜梭菌检验：GB 4789.13-2012 方法要点与培养基控制

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一类重要的厌氧性芽胞杆菌，广泛存在于土壤、尘埃、水体、人和动物肠道以及肉类原料中。它能形成芽胞，对不良环境具有较强耐受性；在大锅饭、肉制品、炖煮食品、汤汁、卤肉、禽肉、调理食品等场景中，如果加热后冷却缓慢、保温不当或复热不足，残存芽胞可能萌发并大量增殖，从而引发食品安全风险。

GB 4789.13-2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》规定了食品中产气荚膜梭菌的检验方法。该方法以TSC琼脂计数和典型菌落确证为核心，适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。与普通需氧菌检测不同，本项目必须重视厌氧培养、样品及时处理、培养基选择性和确证试验，否则容易出现漏检或误判。

一、为什么要检验产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌属于厌氧菌，典型食品风险常与“加热后存放不当”有关。加热可杀灭多数营养细胞，但部分芽胞可能存活；如果食品中心处于低氧或厌氧状态，并在适宜温度范围内长时间缓慢冷却或保温，芽胞可萌发为营养细胞并迅速增殖。食用污染量较高的食品后，细菌在肠道内形成芽胞过程中可产生肠毒素，引起腹泻、腹痛等胃肠道症状。

产气荚膜梭菌食物中毒常见于一次性大量烹调并长时间保温或冷却的大宗食品，例如肉类、禽肉、肉汁、浓汤、炖菜、卤制品和集体供餐食品。日本东京都食品安全资料也指出，产气荚膜梭菌广泛存在于自然界和人畜肠道中，其芽胞耐热，大量烹调食品中心容易形成厌氧状态，若冷却到适合生长温度，细菌可快速增殖，因此常与大规模供餐事件相关。

二、检验方法的基本逻辑

GB 4789.13-2012采用计数法。其基本思路是：样品经稀释后接种TSC琼脂，在厌氧条件下培养；产气荚膜梭菌在TSC琼脂上形成典型黑色菌落；再从典型菌落中挑取一定数量进行确证试验；最后根据典型菌落数和确证比例计算样品中产气荚膜梭菌数量。

这一流程要点可以概括为“选择性计数 + 典型菌落确证”。TSC平板上的黑色菌落只是可疑菌落，不能直接等同于产气荚膜梭菌。最终报告必须结合确证结果计算，而不是简单把所有黑色菌落直接计为目标菌。

三、样品处理：及时、低温和代表性是关键

产气荚膜梭菌检验对样品状态较敏感。样品采集后应尽快检验；若不能及时检验，应按标准和实验室SOP规定保存。样品延迟处理可能带来两类问题：一是营养细胞死亡导致低估；二是在温度控制不当时细菌继续增殖导致高估。

食品样品通常取规定量加入稀释液制成初始稀释液，再按需要制备系列稀释液。对固体、半固体、肉制品、汤汁和调理食品，应特别注意均质充分和样品代表性。大块肉、带骨食品、汤汁分层、脂肪层、固液混合食品都可能造成微生物分布不均。

旧文中提到无法及时检验时使用缓冲甘油-氯化钠溶液并低温保存，这是标准方法中的特殊保存思路。正式检测时应按GB 4789.13-2012和实验室SOP执行，不能随意改变保存条件。

四、TSC琼脂：产气荚膜梭菌计数的核心培养基

TSC琼脂，即胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，是GB 4789.13-2012中用于产气荚膜梭菌分离计数的关键培养基。其作用包括提供营养、形成厌氧或低氧环境下可观察的菌落、利用亚硫酸盐和铁盐形成黑色反应，同时通过环丝氨酸等选择性成分抑制部分背景菌。

典型产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上形成黑色菌落。黑色来自硫化物与铁盐反应形成黑色沉淀，这一特征有助于筛选可疑菌落。但其他能够产生硫化物或适应培养条件的厌氧菌也可能形成类似反应，因此必须进行确证。

TSC琼脂的质量直接影响结果。若选择性过强，可能抑制受损目标菌；若选择性不足，背景菌过多，典型菌落难以判读；若亚硫酸盐或铁盐状态异常，黑色菌落表现可能不典型。

五、厌氧培养：不是可有可无的条件

产气荚膜梭菌为厌氧菌，检测过程必须提供合适厌氧环境。标准方法中，TSC平板凝固后再覆盖一层TSC琼脂，并置于厌氧培养装置内培养。这一设计有两个目的：一是减少氧气对目标菌生长的影响；二是提高典型菌落显色和计数的稳定性。

厌氧条件不足时，可能出现以下问题：

实验室应对厌氧培养装置、厌氧指示剂、培养时间和温度进行记录和确认。厌氧条件不能只凭“放进厌氧罐”判断合格。

六、典型菌落确证：黑色菌落不等于最终结果

TSC平板上的典型黑色菌落需要进一步确证。标准方法中，通常从典型菌落中挑取一定数量接种至液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）培养，再进行革兰氏染色、含铁牛乳培养基试验、缓冲动力-硝酸盐试验和乳糖-明胶试验等确认。

产气荚膜梭菌的典型确认特征包括：革兰氏阳性粗短杆菌；通常无动力；能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；可发酵乳糖并使明胶液化；在含铁牛乳培养基中可出现“暴烈发酵”现象。不同试验结果应综合判断。

确证试验的意义在于修正TSC平板的“疑似计数”。只有经确证符合的菌落，才能按比例参与最终结果计算。

七、结果计算：要考虑确证比例

GB 4789.13-2012不是简单报告TSC平板上黑色菌落数，而是结合确证试验结果进行计算。若挑取的可疑菌落中只有一部分被确认为产气荚膜梭菌，则最终结果应按确证比例折算。这样可以减少把其他黑色菌落误计为目标菌的风险。

结果单位通常以CFU/g或CFU/mL表示。若结果为0，不应简单写“0 CFU/g”，而应按标准规定以小于检出限或小于相应最低稀释倍数的形式报告。

八、常见易错点

产气荚膜梭菌检验的易错点集中在样品保存、厌氧培养、TSC培养基状态、典型菌落挑取和确证判读几个环节。

对培训人员而言，最容易混淆的是“典型菌落数”和“经确证的产气荚膜梭菌数”。前者只是筛选计数，后者才是最终报告的基础。

九、培养基和试剂质量控制

产气荚膜梭菌检验使用多种培养基和试剂，包括TSC琼脂、FTG培养基、缓冲动力-硝酸盐培养基、乳糖-明胶培养基、含铁牛乳培养基、0.1%蛋白胨水、革兰氏染色液、硝酸盐还原试剂和缓冲甘油-氯化钠溶液等。GB 4789.28-2024已列入食品微生物学检验培养基和试剂质量要求标准目录，是培养基和试剂质量控制的重要依据。

对培养基生产企业而言，TSC琼脂不仅要“能长黑菌落”，还要看目标菌恢复率、背景菌抑制、黑色反应强度、覆盖层流动性、灭菌后稳定性和批间一致性。

十、食品企业如何控制产气荚膜梭菌风险

产气荚膜梭菌风险控制的关键不在终产品检测，而在烹调、冷却、保温和复热过程管理。USDA食品安全资料指出，烹调后食品应快速冷却至5℃或以下，或保持在60℃或以上的热保温状态，以防止产气荚膜梭菌芽胞激活和生长。

餐饮、团餐、中央厨房、熟食加工和预制菜企业尤其应关注这一风险。产气荚膜梭菌常见问题不是“完全没加热”，而是“加热后冷却和保温控制失败”。

十一、与其他厌氧芽胞菌的区别

产气荚膜梭菌与肉毒梭菌、艰难梭菌、其他梭菌均属于厌氧芽胞菌范畴，但食品检验目的和标准方法不同。产气荚膜梭菌检验主要关注食品中该菌数量；肉毒梭菌相关标准更关注产毒菌及毒素风险；不同项目不能混用培养基、培养条件和判定逻辑。

因此，不能因为二者都是梭菌，就把风险控制和检验方法混为一谈。

十二、对培养基企业的研发启示

产气荚膜梭菌检验对培养基体系要求较高，特别是厌氧菌恢复、选择性抑制和生化反应一致性。对逗点生物这类培养基企业而言，可从以下方向优化产品和技术支持：

产气荚膜梭菌检验不是单一TSC平板即可完成，完整产品体系应覆盖分离计数、复壮纯培养和确证试验全过程。

十三、旧文中的重点修正

十四、小结

产气荚膜梭菌检验是食品微生物学检验中典型的厌氧芽胞菌计数项目。GB 4789.13-2012以TSC琼脂选择性计数为基础，通过FTG培养、革兰染色、含铁牛乳、动力-硝酸盐和乳糖-明胶等试验进行确证，最终按典型菌落数和确证比例计算结果。

对食品企业而言，控制产气荚膜梭菌风险的关键在于加热后的快速冷却、热保温、复热和大宗熟食过程管理；对培养基企业而言，该项目提示我们，厌氧菌检测培养基不仅要支持目标菌生长，还要保证选择性、显色反应、还原性和确证试验的一致性。只有样品处理、厌氧培养、培养基质量和确证逻辑同时受控，产气荚膜梭菌检验结果才具有可靠性。