抗生素残留检测法（培养法）：原理、关键试剂与结果判定

抗生素残留检测法（培养法）是《中国药典》2015年版中用于检查供试品中氨苄西林或四环素残留的一种微生物抑制法。其基本原理是：抗生素可在琼脂培养基中扩散，并对敏感试验菌产生抑制作用，形成可见抑菌圈。通过比较供试品溶液与对照品溶液对试验菌产生的抑菌圈大小，可判断供试品中是否存在相当于或高于对照品水平的抗生素残留。

需要注意的是，该方法本质上属于生物学效应检测，反映的是供试品对特定试验菌的抑制活性，不是高效液相色谱、质谱等理化方法意义上的精确定量检测。因此，试验菌活性、培养基质量、pH、琼脂厚度、钢管规格、加样量和培养条件都会直接影响结果可靠性。

检测原理与适用对象

培养法利用抗生素在琼脂中的扩散能力和对敏感菌的抑菌活性进行判断。氨苄西林检测通常选用金黄色葡萄球菌作为试验菌，四环素检测通常选用藤黄微球菌作为试验菌。两类抗生素作用机制不同，敏感指示菌也不同，因此不能随意替换菌株或培养条件。

在操作中，先制备含试验菌的菌层培养基，再放置无菌不锈钢钢管，分别加入供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液。培养后观察各孔周围是否形成抑菌圈，并比较供试品与对照品的抑菌圈直径。若对照品有清晰抑菌圈、阴性对照无抑菌圈，说明试验系统成立；再根据供试品抑菌圈大小进行结果判定。

关键试剂与培养基

磷酸盐缓冲液（pH 6.0）用于对照品稀释及阴性对照。其制备方法为：称取磷酸二氢钾8.0 g、磷酸氢二钾2.0 g，加水溶解并稀释至1000 mL，121℃灭菌30分钟。

抗生素Ⅱ号培养基用于平板底层和菌层制备。培养基配方及作用如下：

制备时，应先将胨、牛肉提取粉和酵母浸出粉加水溶解，再加入琼脂加热使其充分溶胀，滤除不溶物后加入葡萄糖，补水至1000 mL。调节pH，使灭菌后pH为6.5～6.6，分装后115℃灭菌30分钟，4℃保存。

对照品溶液与菌悬液制备

氨苄西林对照品溶液制备时，先取适量氨苄西林对照品，用0.01 mol/L盐酸溶解并稀释成每1 mL含氨苄西林10 mg的溶液，再精密量取适量，用磷酸盐缓冲液稀释成每1 mL含1.0 μg的溶液。

四环素对照品溶液制备时，取适量四环素对照品，用生理氯化钠溶液溶解并稀释成每1 mL含0.125 μg的溶液。

氨苄西林检测用金黄色葡萄球菌CMCC 26003。取其营养琼脂斜面培养物，接种于新的营养琼脂斜面，35～37℃培养20～22小时。临用前，用灭菌水或0.9%无菌氯化钠溶液洗下菌苔，制成菌悬液。

四环素检测用藤黄微球菌CMCC(B) 28001。取其营养琼脂斜面培养物，接种于新的营养琼脂斜面，26～27℃培养24小时。临用前，用0.9%无菌氯化钠溶液洗下菌苔，制成菌悬液。

检查方法

取直径8 cm或10 cm的培养皿，加入融化的抗生素Ⅱ号培养基15～20 mL，使其在皿底均匀摊布，放置于水平操作台上凝固，作为底层。

另取抗生素Ⅱ号培养基10～15 mL，置于50℃水浴中预热的试管内，加入0.5%～1.5%（mL/mL）的菌悬液300 μL，混匀后注入已铺好底层的培养皿中，放置于水平操作台上冷却凝固，形成含菌上层。

凝固后，在每个培养皿上等距离放置无菌不锈钢钢管。钢管内径宜为6～8 mm，壁厚1～2 mm，管高10～15 mm，表面应光滑平整。随后分别向钢管中加入供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液。加样后将培养皿置37℃培养18～22小时，观察抑菌圈形成情况。

结果判定与质量控制要点

结果判定的前提是对照系统有效：对照品溶液应形成清晰抑菌圈，阴性对照溶液不应形成抑菌圈。若阴性对照出现抑菌圈，提示缓冲液、器具或操作过程可能存在污染或异常抑菌因素；若对照品无抑菌圈，则可能与对照品失效、试验菌活性不足、培养基质量异常或操作条件不当有关，该次试验不宜用于判定。

在系统有效的前提下，若供试品溶液抑菌圈直径小于对照品溶液抑菌圈直径，判为阴性；若供试品溶液抑菌圈直径大于或等于对照品溶液抑菌圈直径，判为阳性。

培养法对操作一致性要求较高。培养基厚度、钢管位置、加样体积、菌悬液浓度、培养时间和培养温度均需保持一致，否则会影响抑菌圈大小。所有玻璃器具、钢管和操作材料均应无菌，平板制备时应避免气泡、倾斜和表面不平整，以减少扩散误差。对于研发和质量控制工作而言，除关注最终阴阳性结果外，还应重点监控试验菌生长状态、对照品抑菌圈稳定性及培养基批间一致性。