支原体检查法：培养法与指示细胞培养法的原理和操作要点

支原体是一类体积小、无细胞壁、可通过普通除菌滤膜的微生物，常见于细胞培养体系、病毒种子批和生物制品生产过程。由于支原体污染不一定引起培养液明显浑浊，且普通细菌培养基难以检出，因此在细胞库、病毒种子批、对照细胞及细胞治疗相关样品中，支原体检查是重要的质量控制项目。

根据2015年版《中国药典》相关要求，主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，通常应同时采用培养法和指示细胞培养法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液一般采用培养法检查支原体，必要时也可采用指示细胞培养法进行辅助筛查。经国家药品检定机构认可的其他方法，也可在验证合格后使用。

一、培养法：以营养支持和变色反应判断支原体生长

培养法是药典支原体检查中的经典方法，核心是使用能够支持支原体生长的液体、半流体或琼脂培养基，在适宜温度下进行较长时间培养，并结合培养基变色、转种培养或固体培养观察判断是否存在支原体污染。

常用推荐培养基包括支原体肉汤培养基和精氨酸支原体肉汤培养基。前者适用于部分发酵葡萄糖的支原体，后者通过加入L-精氨酸，适用于部分可分解精氨酸的支原体。培养基中常加入酚红作为酸碱指示剂，支原体代谢底物后可引起pH变化，从而使培养基颜色发生变化。

半流体培养基可按上述液体培养基处方配制，但不加入酚红，另加入琼脂2.5～3.0 g/L；支原体琼脂培养基同样不加酚红，加入琼脂13.0～15.0 g/L。除药典推荐培养基外，也可使用其他经验证能够支持支原体生长的培养基，但其灵敏度必须符合要求。

二、培养基灵敏度检查：确认培养基能检出低水平支原体

支原体培养基在使用前或定期质量抽检时，应进行灵敏度检查。常用菌种包括肺炎支原体 ATCC 15531 和口腔支原体 ATCC 23714。

操作时，将菌种接种于适宜支原体培养基中，于36℃±1℃培养至培养基变色，并盲传两代。随后将培养物接种至待检培养基中，进行10倍系列稀释。肺炎支原体通常稀释至10⁻⁷～10⁻⁹，接种于支原体肉汤培养基；口腔支原体通常稀释至10⁻³～10⁻⁵，接种于精氨酸支原体肉汤培养基。每个稀释度接种3支试管，于36℃±1℃培养7～14天，观察变色结果。

结果判定时，以接种后2/3以上培养管发生变色的最高稀释度作为培养基灵敏度。液体培养基灵敏度应达到：肺炎支原体 ATCC 15531 不低于10⁻⁸，口腔支原体 ATCC 23714 不低于10⁻⁴。质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检培养基灵敏度，避免因培养基营养不足、血清质量不稳定或抑制因素过强导致漏检。

三、供试品培养检查：样品保存、接种与转种观察

供试品如在分装后24小时内进行支原体检查，可置2～8℃保存；超过24小时，应置-20℃以下保存，以降低支原体活性变化或样品降解对结果的影响。

检查时通常采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基，也可使用支原体琼脂培养基。半流体培养基或琼脂培养基在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至约56℃后，加入灭活小牛血清，培养基与血清比例为8:2，并可酌情加入适量青霉素。青霉素主要用于抑制部分细菌污染，由于支原体无细胞壁，对青霉素不敏感，因此不会作为主要抑制支原体的成分。液体培养基使用前不需煮沸，但同样应补加灭活小牛血清等成分。

检查时，取装量为10 mL的支原体液体培养基4支，以及相应支原体半流体培养基2支。每支培养基接种供试品0.5～1.0 mL，于36℃±1℃培养21天。接种后第7天，从4支支原体液体培养基中取2支进行次代培养，分别转种至相应支原体半流体培养基和支原体液体培养基中，继续于36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。

培养结束时，如所有接种供试品的培养基均无支原体生长迹象，可判定供试品符合要求。如疑有支原体生长，应取加倍量供试品复试；复试无支原体生长时，可判为合格；复试仍有支原体生长时，判为不合格。

四、指示细胞培养法：用DNA荧光染色观察支原体污染

指示细胞培养法又称DNA染色法，是将供试品接种于已确认无支原体污染的指示细胞中培养，再用Hoechst 33258等DNA荧光染料染色。若供试品中存在支原体，支原体可附着于细胞表面或周围，在荧光显微镜下表现为大小不等、不规则的荧光颗粒。

常用指示细胞为Vero细胞，也可采用经国家药品检定机构认可的其他细胞。指示细胞应预先证明无支原体污染，且供试品不得明显影响其正常生长。若供试品为细胞培养物，应先经无抗生素培养液至少传一代，再取细胞长满且3天未换液的培养上清液进行检测。若供试品为毒种悬液，并且该毒种会导致指示细胞病变而影响结果判断，应先使用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒，或改用不产生细胞病变的其他指示细胞。

染色试剂中，Hoechst 33258浓缩液可按5 mg加入100 mL不含酚红和碳酸氢钠的Hank’s平衡盐溶液配制，室温磁力搅拌30～40分钟使其溶解，-20℃避光保存。工作液则取浓缩液1 mL加入100 mL无酚红、无碳酸氢钠的Hank’s溶液中混匀。固定液可采用乙酸:甲醇=1:3的混合液，封片液可由枸橼酸溶液、磷酸氢二钠溶液和甘油配制，并调pH至5.5左右。

测定时，在制备好的指示细胞培养板中加入供试品，一般细胞培养上清液加2 mL，毒种或其他供试品至少加1 mL，于5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3～5天。指示细胞培养物至少传代1次，末次传代使用含盖玻片的培养板培养3～5天。随后吸出培养液，加入固定液固定，空气干燥后加入DNA荧光染料工作液染色，洗涤、干燥、封片后用荧光显微镜观察。

结果判定时，阴性对照应仅见指示细胞细胞核呈黄绿色荧光；阳性对照除细胞核外，还可见细胞外或细胞周围大小不等、不规则的荧光着色颗粒。只有阴性对照和阳性对照结果均成立时，试验才有效。供试品结果为阴性时，判为合格；供试品结果为阳性或可疑时，应进行重试；重试仍为阳性时，判为不合格。

五、方法应用要点

培养法和DNA染色法各有侧重。培养法可检出具有生长能力的支原体，结果较直观，但周期较长，对培养基营养、血清质量和培养条件要求较高。指示细胞培养法观察速度相对较快，适合发现附着于细胞表面的支原体DNA信号，但对指示细胞状态、供试品细胞毒性和荧光显微镜判读经验有较高要求。

在实际检验中，应重点控制三类风险：一是培养基灵敏度不足导致假阴性；二是供试品对支原体或指示细胞存在抑制作用，影响检出；三是操作环境或细胞体系本身污染导致假阳性。对于细胞库、病毒种子批和细胞治疗相关样品，支原体检查不应只关注终点结果，还应重视样品保存、无抗生素传代、阳性/阴性对照、培养基灵敏度和复试规则等全过程控制。

支原体污染一旦发生，可能影响细胞生长、代谢、病毒增殖、蛋白表达及生物制品安全性。因此，规范开展支原体检查，是细胞培养和生物制品质量控制中不可缺少的基础环节。