抑菌效力检查法：从2015版药典修订看防腐体系的质量控制

抑菌效力检查法是药品微生物控制中的重要方法，主要用于评价无菌及非无菌制剂中抑菌剂，也称防腐剂，是否能够在产品贮存和使用过程中有效抑制微生物污染后的生长。对于多剂量包装制剂、水性制剂、眼用制剂、口服液体制剂、外用制剂等产品，抑菌效力直接关系到产品开封使用期间的微生物安全。

2015年版《中国药典》在2010年版抑菌剂效力检查法指导原则基础上，对方法名称、培养基、培养基适用性、菌液制备、产品分类和判断标准等内容进行了修订，使其更接近欧洲药典等国际药典体系。该修订的核心意义，是把“是否加入防腐剂”进一步转变为“防腐体系是否经微生物挑战试验证明有效”。

一、什么是抑菌剂？

抑菌剂是指能够抑制微生物生长的化学物质，在药品制剂中也常称为防腐剂。常见防腐剂包括羟苯酯类、苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、苯甲醇、氯丁醇、硫柳汞等。不同抑菌剂的适用pH、抑菌谱、毒性、相容性和稳定性差异较大。

需要明确的是，抑菌剂不能替代GMP管理，也不能作为降低生产过程微生物污染的唯一措施。防腐剂的作用是在产品正常贮存和使用过程中，降低偶然污染后微生物繁殖造成的风险，尤其适用于多剂量包装制剂。由于多数抑菌剂具有一定毒性或刺激性，处方中应使用最低有效浓度，而不是浓度越高越好。

二、2015版药典修订的主要变化

2015版药典将“抑菌剂效力检查法指导原则”进一步规范为“抑菌效力检查法”，并在概述中明确抑菌剂定义。方法不再只作为原则性参考，而是成为评价添加防腐剂制剂抑菌能力的重要通则。

培养基名称也进行了规范。例如，旧称“胰酪胨大豆肉汤培养基”修订为“胰酪大豆胨液体培养基”；“胰酪胨大豆琼脂培养基”修订为“胰酪大豆胨琼脂培养基”。原资料中的“胰酪大豆胨轻质培养基”应为录入错误，应修正为“胰酪大豆胨琼脂培养基”。

培养时间表述也从较固定的“48 h/72 h”调整为更适合实际菌株生长的区间，例如细菌培养不超过3天，霉菌和酵母菌培养不超过5天。菌液制备可使用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。培养基适用性和方法适用性试验中，试验菌回收率通常以不低于70%作为合格要求。

此外，2015版药典按给药途径对产品进行分类，并参照欧洲药典思路设置不同抑菌效力判断标准。结果判断中的初始值以实际加入供试品中的菌数为基准，计算后续各时间点菌数下降的lg值，而不是简单以“0时测定值”作为唯一初始依据。

三、抑菌效力检查的应用场景

抑菌效力检查主要有两个用途。第一，用于评价最终产品的防腐体系是否有效。对于已上市或拟上市制剂，若处方中加入抑菌剂，应通过抑菌效力检查证明其在产品有效期内仍能发挥足够抑菌作用。

第二，用于制剂研发阶段防腐剂种类和最低有效浓度的筛选。研发时通常需要结合供试品理化性质、pH、包装系统、使用方式和给药部位，先进行抑菌剂配比浓度预实验，再进行证实试验。理想状态是既能达到药典抑菌效力要求，又不增加刺激性、毒性或相容性风险。

例如，眼用制剂对防腐剂刺激性要求较高；口服液体制剂更关注开封反复使用后的微生物污染风险；皮肤给药制剂则需考虑处方中油相、表面活性剂、pH和包装方式对防腐剂分布和活性的影响。

四、试验用培养基和试验菌

抑菌效力检查常用培养基包括胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。其中，胰酪大豆胨类培养基主要用于细菌培养和计数，沙氏葡萄糖类培养基主要用于霉菌和酵母菌培养和计数。

常用试验菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉。金黄色葡萄球菌代表常见革兰氏阳性污染菌；铜绿假单胞菌代表水性环境中较难控制的革兰氏阴性菌；大肠埃希菌常用于口服制剂等相关场景；白色念珠菌和黑曲霉分别代表酵母菌和霉菌污染风险。

试验菌应来源清楚，传代次数受控，并保持典型生物学特性。细菌通常用胰酪大豆胨琼脂或液体培养基在30～35℃培养18～24小时；白色念珠菌通常用沙氏葡萄糖培养基在20～25℃培养24～48小时；黑曲霉需培养至形成丰富孢子后制备孢子悬液。

五、培养基适用性检查

培养基适用性检查的目的，是证明本次使用的培养基能够支持试验菌生长，不会因培养基质量问题导致假阴性。操作时，将不大于100 CFU的试验菌分别接种于被检培养基和对照培养基中，按规定条件培养并计数。

若被检培养基上的菌落平均数不低于对照培养基的70%，且菌落形态、大小与对照培养基基本一致，可判定该培养基适用性符合要求。若培养基促生长能力不足，即使供试品本身抑菌效力看似良好，也可能是培养基无法有效恢复微生物造成的错误结果。

因此，抑菌效力检查不能省略培养基适用性。对于商品化干粉培养基、成品培养基或实验室自配培养基，均应按要求进行适用性确认。

六、方法适用性试验：确认样品中的微生物能被检出

抑菌效力检查的难点在于，供试品本身往往含有抑菌剂或具有抑菌性。若直接取样计数，残留抑菌剂可能在平板上继续抑制试验菌生长，导致存活菌数被低估。因此，正式测定前必须建立经验证的存活菌数测定方法。

方法适用性试验需要证明：在供试品存在的情况下，试验菌仍能被有效回收。常用解决方案包括稀释法、薄膜过滤法、加入中和剂或灭活剂、增加冲洗液体积、改变稀释液体系等。若使用中和剂，应同时证明其能有效中和供试品抑菌作用，且对试验菌无毒性。

方法适用性回收率通常要求不低于70%。若回收率达不到要求，应优化中和方式或计数方法，不能直接进入正式抑菌效力测定。

七、抑菌效力测定的基本步骤

正式测定时，应制备较高浓度试验菌悬液，一般为10⁶～10⁸ CFU/mL水平，以便接种后使每1 g或1 mL供试品中的最终接菌量达到10⁵～10⁶ CFU。接种菌液体积不得超过供试品体积的1%，以避免稀释供试品、改变抑菌剂浓度或影响产品体系。

供试品应尽量在原包装容器中接种试验菌。原因是抑菌效力可能受包装材料、容器形状、装量、封口方式和抑菌剂吸附等因素影响。若因装量或性状限制必须转移至无菌容器，容器材质不得吸附抑菌剂，也不得改变供试品pH或其他关键特性。

接种后充分混匀，并置20～25℃避光贮存。按各类制剂规定的时间点取样，使用经验证的存活菌数测定方法进行计数。细菌通常用胰酪大豆胨琼脂培养基计数，真菌通常用沙氏葡萄糖琼脂培养基计数。

八、结果计算与判断

结果判断以接种后供试品中初始加入菌数的lg值为基准，计算各规定时间点存活菌数lg值的下降幅度。所谓“减少的lg值”，就是初始接菌量lg值与某一时间点存活菌数lg值之间的差值。

例如，初始接菌量为10⁵ CFU/mL，14天后存活菌数为10² CFU/mL，则减少的lg值为3。若后续时间点菌数未增加，则说明供试品在该阶段能够维持抑菌效果。药典判断标准根据产品给药途径分为不同类别，不同类别对细菌和真菌在不同时间点的下降幅度要求不同。

通常情况下，注射剂、眼用制剂及用于子宫和乳腺等高风险部位的制剂要求更严格；耳用、鼻用、皮肤给药和吸入制剂要求次之；口服、口腔黏膜和直肠给药制剂则按其使用风险设定相应标准。企业应按产品类别和现行药典表格进行判断，不能用同一个下降标准评价所有制剂。

结果计算时，lg值宜保留小数点后一位。若某一时间点菌数低于方法检出限，应按药典或实验室SOP规定进行换算和记录，并在报告中说明。

九、抑菌效力检查不是防腐剂含量测定

抑菌效力检查评价的是产品整体防腐体系，而不是单纯测定防腐剂含量。即使防腐剂含量符合处方限度，也不代表抑菌效力一定合格。因为防腐剂活性会受到pH、表面活性剂、油水分配、蛋白质、包装材料吸附、产品黏度、离子强度和贮藏时间影响。

反过来，若产品本身具有足够抗菌效力，也可能不需要额外加入防腐剂，但应有充分试验证据支持。对于添加防腐剂的制剂，还应在稳定性研究中关注有效期内抑菌效力是否下降，特别是多剂量包装产品和开封后使用时间较长的产品。

十、对培养基和试剂企业的启示

抑菌效力检查对培养基和微生物试剂质量提出了较高要求。胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖琼脂、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、聚山梨酯80、中和剂和稀释液体系，都会影响试验菌恢复和计数结果。

培养基企业应重点控制培养基促生长能力、pH、澄清度、凝胶强度、批间一致性、无菌性和适用性检查结果。对于抑菌性较强的制剂，还应提供中和剂、稀释液、薄膜过滤冲洗液等配套技术方案，帮助客户建立方法适用性。

对研发和质控人员而言，抑菌效力检查不只是一个药典项目，更是处方开发、包装选择、稳定性研究和微生物风险控制之间的连接点。培养基和试剂的稳定性，直接决定该方法能否准确评价制剂真实防腐能力。

结语

2015版《中国药典》对抑菌效力检查法的修订，使防腐剂评价从原则性要求进一步走向标准化、定量化和分类判定。该方法通过微生物挑战试验，验证制剂在受到一定水平微生物污染后，能否在规定时间内使微生物数量下降并保持不再增加。

对于药品生产企业，抑菌效力检查可用于最终产品质量评价，也可用于研发阶段防腐剂种类和最低有效浓度筛选。对于微生物培养基企业，稳定可靠的培养基、稀释液和中和体系，是抑菌效力检查准确实施的基础。只有方法适用性、培养基适用性和试验操作都受控，抑菌效力结果才真正具有质量控制意义。