瓷珠保藏法：食品微生物实验室菌种长期保存的实用方法

菌种是微生物实验室最基础的“活标准”。培养基质控、方法验证、阳性对照、能力验证和日常检测，都离不开稳定、可追溯的菌株。若菌种保存不当，可能出现死亡、污染、性状退化、传代次数失控或典型反应改变，直接影响实验结果。

瓷珠保藏法是一种常用低温菌种保存方法。其基本原理是利用多孔玻璃珠或素烧瓷珠吸附菌悬液，在低温条件下保存。复苏时只需取出一粒瓷珠接种培养基，剩余瓷珠继续冻存，可减少反复冻融和频繁传代带来的风险。该方法在食品微生物实验室、培养基质控实验室和菌株日常管理中具有较高实用价值。

一、瓷珠保藏法适合解决什么问题？

传统斜面传代保存操作简单，但需要定期转接。每一次传代都可能带来污染、突变、性状漂移和编号混乱风险。对于质控菌株，频繁传代还会影响代数控制，使菌株逐渐偏离原始保藏状态。

瓷珠保藏法的优势在于：每管可含多粒瓷珠，每次复苏只取一粒，避免整管菌种反复冻融；保存温度低，代谢活动明显降低；操作相对简便；便于建立主种子批、储备菌株和工作菌株体系。对于大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等常用质控菌株，瓷珠冻存是一种较为方便的实验室保存方式。

但它不是所有微生物的最佳方法。部分严格厌氧菌、弯曲菌、脆弱菌、特殊真菌、难培养菌或对冷冻敏感的菌株，可能需要液氮、真空冷冻干燥、专用保护液或更严格的复苏条件。实验室应根据菌种特性选择保藏方法，不能机械地把所有菌株都套用同一方法。

二、标准依据与管理定位

SN/T 2660—2010《食品微生物实验室菌种保藏方法》规定了食品微生物实验室常用菌种保藏的定义、技术原则、技术要求和技术方法。该标准在全国标准信息公共服务平台显示为现行，适用于食品微生物实验室菌种保藏。

此外，食品微生物检验用培养基和试剂质量控制还应关注GB 4789.28—2024《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》。该标准适用于食品微生物学检验用培养基和试剂质量控制，并涉及质控菌株的使用逻辑。 因此，瓷珠保藏法不应只被看作一个“冻菌操作”，而应纳入菌种管理、培养基适用性检查和实验室质量体系中统一管理。

三、设备和材料

瓷珠保藏法通常需要低温冰箱、高压蒸汽灭菌器、无菌冻存管、多孔玻璃珠或素烧瓷珠、合适的菌种保护液或培养基、无菌接种环、无菌吸头、标签和菌种台账。

低温保存温度通常为-70℃或更低，实际实验室中常使用-80℃低温冰箱。温度应连续监测或定期记录，并设置报警、备用电源或应急转移方案。低温冰箱不是普通储物设备，而是菌种质量和追溯性的关键设施。

瓷珠直径一般为2～3 mm，每管装入适量瓷珠，不宜过多，以保证菌悬液能充分接触并便于后续单粒取出。冻存管应耐低温、密封性好、标签牢固，避免低温下开裂、脱盖或标识脱落。商业化瓷珠冻存管可按说明书使用，但仍需纳入实验室验收、批号记录和适用性管理。

四、菌种准备：先确认纯度，再进行保藏

用于保藏的菌种应来自可靠来源，如标准菌株、参考菌株、经确认的实验室保藏株或经过鉴定的环境分离株。保藏前必须进行纯度检查，必要时还应确认菌落形态、显微镜形态、生化特征、血清学特征、MALDI-TOF MS鉴定或分子鉴定结果。

菌株应在适宜培养基和适宜条件下培养至合适阶段。细菌通常取新鲜、典型、纯净培养物；芽孢菌应根据目的选择营养细胞或成熟芽孢；酵母菌宜选择生长良好的新鲜培养物；丝状真菌则应根据孢子形成情况和菌株特性选择更合适的保藏方式。

旧文中“培养至稳定期或成熟期”可保留，但应补充前提：保藏菌株必须处于活力良好、典型性状稳定、无污染的状态。状态不佳的菌株即使冻存成功，也可能在复苏后表现为生长弱、典型反应不清或结果不稳定。

五、瓷珠保藏基本操作

首先，将多孔玻璃珠或素烧瓷珠分装入小螺旋盖瓶或冻存管中，每管装量应便于菌液充分润湿和后续取珠。经高压蒸汽灭菌后备用。冻存管应预先标记菌株名称、菌株编号、来源、保藏日期、代次、保藏人和保存位置。

在无菌条件下打开冻存管，将新鲜纯培养物制成菌悬液。菌悬液可使用适合该菌株的保护液、冻存液或经验证适用的培养基体系。对于商品化瓷珠冻存管，应按厂家说明书加入菌悬液和处理多余液体。

加入菌悬液后，轻轻颠倒冻存管4～5次，使菌悬液与瓷珠充分接触。原文中“切勿涡旋振荡”有实际意义：剧烈涡旋可能造成气溶胶、污染、细胞损伤或泡沫，不利于标准化操作。待菌体吸附于瓷珠后，吸出多余菌悬液，使瓷珠表面保持湿润但不应残留过多液体。

最后，封紧冻存管，检查标签和记录，将其迅速转入-70℃或-80℃低温条件保存。冻存位置应固定，并在菌种台账中记录冻存管编号、盒号、孔位和保存数量。

六、保藏周期不能只写“10年”

原文中“可保存10年”的说法应谨慎使用。某些标准或经验资料可给出长期保存周期，但实际可保存时间与菌种类型、保护液、冻存温度、冻存管密封性、是否断电升温、复苏条件和菌株本身耐受性有关。

更严谨的表述应为：瓷珠保藏法可用于长期低温保存，具体保存期限应通过实验室验证、文献或标准依据、定期复苏检查和菌株特性确认确定。对关键质控菌株，实验室不应只依赖保存年限，而应建立定期核查制度。

定期核查可包括：低温冰箱温度记录、冻存管外观、复苏成功率、纯度检查、典型菌落形态、关键生化或鉴定特征、质控反应和传代记录。若复苏率下降、性状异常或污染，应停止使用该冻存批次，并追溯原因。

七、复苏培养：只取一粒，避免反复冻融

复苏时，应在无菌条件下快速打开冻存管，用无菌针、无菌镊子或接种环取出一粒瓷珠。原文中的“无菌真”应修正为“无菌针”或“无菌镊子”。取珠后应立即封好冻存管，并尽快放回低温冰箱，减少剩余瓷珠温度波动。

取出的瓷珠可直接滚涂或接种于适宜固体培养基表面，也可投入少量液体培养基中复苏。复苏培养基和培养条件应与菌株特性匹配。例如，肠杆菌科可用营养丰富的非选择性培养基复苏；金黄色葡萄球菌可用TSA或血平板等；乳酸菌可能需要MRS体系；弯曲菌等特殊菌需微需氧和专用培养基；真菌则应选择适宜真菌培养基。

复苏后应检查纯度和典型性状。用于培养基质控或检测方法验证前，还应按实验室规定进行工作菌株制备和代数管理。不要把刚复苏、状态不稳定或纯度未确认的培养物直接用于关键质控。

八、记录和标签是菌种管理的底线

菌种保存失败，很多时候不是因为冻存方法本身，而是因为记录和标签管理不严。每一支冻存管都应能追溯到菌株来源、编号、代次、保藏日期、保藏方法、冻存位置、复苏记录和使用记录。

菌种台账至少应包括：菌株中文名和拉丁名、编号、来源机构、接收日期、原始证书或说明、保藏方法、保藏批次、冻存位置、复苏日期、使用人、传代次数、纯度检查结果、鉴定结果和销毁记录。

对于食品微生物实验室和培养基质控实验室，还应区分原始菌株、储备菌株和工作菌株。原始菌株尽量减少开启；储备菌株用于制备工作菌株；工作菌株用于日常试验。这样可以降低传代次数，保持菌株稳定性。

九、常见失败原因

瓷珠保藏失败常见原因包括：菌株状态差、菌悬液浓度过低、保护液不适合、瓷珠未充分吸附、冻存管密封不良、保存温度波动、复苏时整管反复升温、取珠操作污染、标签脱落或冻存位置记录错误。

复苏失败时，不应简单判定菌株死亡。应排查复苏培养基是否合适、培养温度和气氛是否正确、复苏时间是否足够、菌株是否需要特殊营养或较长恢复期、低温冰箱是否曾出现升温、冻存管是否漏液。必要时取同批另一粒瓷珠复苏，并与备用保藏方法进行比对。

如果某菌株对瓷珠冻存不稳定，应改用甘油低温冻存、液氮保藏、真空冷冻干燥、液体石蜡保藏或其他更合适方法。重要菌株建议采用两种以上保藏方式备份，以降低丢失风险。

十、生物安全要求

菌种保藏和复苏应在符合生物安全要求的条件下进行。涉及致病菌或条件致病菌时，应在生物安全柜中操作，避免产生气溶胶。使用过的吸头、接种环、冻存管、培养基和污染耗材应经有效灭菌后处理。

冻存管破裂、漏液、标签污染或低温盒结霜严重时，应按实验室生物安全程序处理。低温保存并不等于无风险，冻存状态下的菌株复苏后仍可能具有感染性或环境污染风险。

实验室还应建立菌种领用、转移、销毁和异常报告制度。未经授权人员不得随意取用菌株，致病菌和重要质控菌株不得无记录转移或外借。

十一、对培养基企业的启示

对于微生物培养基企业，瓷珠保藏法直接关系到质控菌株稳定性。培养基促生长、选择性、抑制性、显色反应和生化反应测试，都依赖稳定可靠的质控菌株。如果菌株因保存不当发生性状变化，培养基性能评价就可能失真。

企业应建立菌种保藏体系：原始菌株低温长期保藏，储备菌株分批建立，工作菌株按周期制备和使用。每批工作菌株用于质控前，应确认纯度、典型反应和生长状态。对于关键培养基，例如Baird-Parker琼脂、VRBA、XLD、mCCDA、PALCAM、MRS、SDA、TSA等，应确保相应质控菌株来源可靠、代次受控、复苏状态一致。

瓷珠保藏法的价值不只是“保存菌株”，而是帮助实验室减少频繁传代，维持质控菌株稳定性，从而提高培养基批间评价的可靠性。

结语

瓷珠保藏法是一种适合食品微生物实验室和培养基质控实验室使用的低温菌种保存方法。它利用多孔玻璃珠或素烧瓷珠吸附菌体，在-70℃或-80℃条件下保存；复苏时每次只取一粒瓷珠，可减少反复冻融和传代风险。

但瓷珠保藏并不是简单“冻起来就行”。菌种纯度、培养状态、保护液、无菌操作、低温稳定性、复苏确认、记录追溯和生物安全管理，都是决定保存效果的关键。对于微生物培养基企业，规范的菌种保藏体系是培养基质量控制的基础，也是确保产品性能数据可信的重要前提。