食品中单核细胞增生李斯特氏菌计数方法：平板计数法与MPN法解析

一、单核细胞增生李斯特氏菌定量检测概述

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是食品安全领域重点关注的食源性致病菌之一。除定性检测外，对于部分食品样品，还需要进一步了解其污染水平，即检测样品中单增李斯特菌的数量。

根据食品中菌量水平及背景微生物情况，单增李斯特菌定量检测主要包括：

• 第二法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法

• 第三法：单核细胞增生李斯特氏菌MPN（最大可能数）计数法

其中：

• 平板计数法适用于单增李斯特菌数量较高、背景干扰较少的样品；

• MPN法适用于菌量较低、杂菌较多或难以直接计数的食品样品。

两种方法均需要结合选择性增菌、显色培养和菌落确认，以保证检测结果的准确性。

二、单增李斯特菌平板计数法

1. 样品制备与梯度稀释

检测时采用无菌操作称取样品：

• 固体样品：25 g；

• 液体样品：25 mL。

加入225 mL缓冲蛋白胨水（BPW）或无选择性LB肉汤，经均质处理制备：

1:10样品匀液。

随后进行10倍系列稀释，制备不同浓度的样品液，以便选择合适的计数范围。

需要注意：

单增李斯特菌属于革兰阳性菌，对环境适应能力较强，但在食品样品中通常数量较低，因此稀释度选择需要结合样品污染情况。

三、选择性显色培养与菌落计数

1. 平板接种

根据样品污染程度选择2～3个连续稀释度，每个稀释度取1 mL样品液，采用涂布法接种于：

• 李斯特菌显色培养基；

• ALOA琼脂。

通常采用：

0.3 mL + 0.3 mL + 0.4 mL

方式分别涂布于3个平板，以提高计数准确性。

培养条件：

• 温度：36 ℃±1 ℃；

• 时间：24～48 h。

2. ALOA培养基上的典型菌落

ALOA培养基是目前常用的李斯特菌显色培养基之一，其鉴别原理主要基于：

1. β-葡萄糖苷酶活性；

2. 磷脂酶活性。

单增李斯特菌典型表现：

• 蓝绿色菌落；

• 周围具有不透明晕圈。

需要注意：

ALOA上的典型菌落并不能完全等同于单增李斯特菌，因为部分其他李斯特菌也可能表现类似特征，因此必须进行后续确认。

四、典型菌落确认与计数原则

在计数时，应选择：

• 同一稀释度3个平板菌落总数15～150 CFU；

• 具有典型单增李斯特菌形态的菌落。

随后随机挑取：

• 5个典型菌落；

• 若少于5个，则全部进行鉴定。

确认方法包括：

• 革兰染色；

• 动力试验；

• 过氧化氢酶试验；

• 糖发酵试验；

• 溶血试验；

• 生化鉴定系统或质谱鉴定。

最终根据：

典型菌落比例 × 确证阳性比例 × 稀释倍数

计算样品中的单增李斯特菌数量。

检测结果以：

CFU/g 或 CFU/mL

表示。

五、单增李斯特菌MPN计数法

1. MPN方法原理

MPN（Most Probable Number，最大可能数）是一种基于统计学估算微生物数量的方法。

其基本原理：

通过不同稀释度多管培养，根据阳性管数量，通过MPN检索表计算样品中目标菌的最可能数量。

该方法特别适用于：

• 菌量较低样品；

• 食品基质复杂样品；

• 直接平板计数困难的样品。

六、MPN检测流程

1. 初级增菌

样品按照平板计数方法制备10倍系列稀释液。

选择3个连续稀释度：

分别接种于LB1增菌液。

每个稀释度：

• 3管；

• 每管接种1 mL。

培养条件：

30 ℃±1 ℃培养24 h。

2. 二级增菌

每管LB1培养液取：

0.1 mL

转入：

10 mL LB2增菌液。

继续培养：

30 ℃±1 ℃，24 h左右。

3. 分离培养

从每个增菌管中取培养液接种：

• 李斯特菌显色培养基；

• ALOA平板。

培养：

36 ℃±1 ℃，24～48 h。

观察典型菌落，并进行确认鉴定。

七、MPN结果判定

根据每个稀释度中：

• 阳性管数量；

• 确认阳性的培养管数量；

查阅MPN检索表，计算：

每g（mL）样品中单核细胞增生李斯特氏菌最可能数量。

结果报告：

MPN/g（mL）

例如：

• 10 MPN/g；

• ＜1 MPN/g。

八、检测培养基体系及作用

1. 缓冲蛋白胨水（BPW）

主要作用：

• 提供温和复苏环境；

• 保护受损细胞；

• 用于样品初始稀释。

主要成分：

2. 李氏增菌肉汤（LB1/LB2）

主要用于选择性富集单增李斯特菌。

主要特点：

• 高盐环境抑制部分杂菌；

• 七叶苷用于李斯特菌代谢检测；

• 吖啶黄、萘啶酮酸抑制伴随菌。

3. ALOA培养基

主要用于：

• 李斯特菌分离；

• 单增李斯特菌初步鉴别。

关键成分：

4. PALCAM培养基

主要特点：

• 七叶苷阳性产生黑色沉淀；

• 甘露醇和指示剂辅助鉴别；

• 适合食品中李斯特菌分离。

九、检测质量控制要求

单增李斯特菌计数方法对培养基性能要求较高，需要使用标准菌株进行质量控制。

常用菌株包括：

质量评价重点：

• 增菌液促进目标菌恢复；

• 选择培养基具有抑制性；

• 显色反应稳定；

• 典型菌落特征符合要求。

十、总结

食品中单核细胞增生李斯特氏菌定量检测主要采用平板计数法和MPN法。

其中：

• 平板计数法具有操作简单、结果直观的特点，适用于菌量较高样品；

• MPN法通过统计学估算菌量，更适用于低污染或复杂食品基质。

无论采用何种方法，均需要结合选择性培养、显色培养和菌落确认，以避免由于非目标李斯特菌或背景菌导致的误判。

随着食品安全检测技术的发展，显色培养基、自动化鉴定系统、MALDI-TOF质谱和PCR技术逐渐应用于单增李斯特菌检测，使检测过程更加快速、准确和标准化。逗点生物提供李斯特菌检测相关增菌培养基、选择性分离培养基及显色培养基产品，为食品微生物实验室质量控制和风险监测提供可靠支持。