双歧杆菌检验方法解析：培养计数、菌种鉴定及有机酸分析技术
- 2026-07-08 09:14:44
- 逗点生物
双歧杆菌检验方法解析：培养计数、菌种鉴定及有机酸分析技术
一、双歧杆菌概述及检测意义
双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类革兰氏阳性、严格厌氧、不形成芽孢的乳酸菌，广泛存在于人和动物肠道中，是人体肠道微生态的重要组成成员。
双歧杆菌能够利用糖类进行发酵，主要代谢产物包括乙酸和乳酸，部分种类还可产生其他有机酸。由于其具有调节肠道菌群、维持微生态平衡等作用，双歧杆菌被广泛应用于：
发酵乳制品；
益生菌制剂；
婴幼儿食品；
功能性食品。
随着益生菌产品的发展，对食品中双歧杆菌的菌种鉴定和活菌数量检测成为评价产品质量的重要指标。
双歧杆菌检测主要包括：
双歧杆菌纯菌菌种鉴定；
食品中双歧杆菌属计数；
菌种形态、生化特征及代谢产物分析。
二、双歧杆菌检测原理
双歧杆菌属于严格厌氧菌，对培养环境要求较高，因此检测过程中需要：
低氧或无氧培养条件；
富含营养物质的选择性培养基；
适宜的培养温度。
检测通常采用：
双歧杆菌选择性培养基 → 厌氧培养 → 菌落计数 → 纯培养鉴定
通过菌落形态、革兰染色、生化特征以及有机酸代谢产物分析，对双歧杆菌进行确认。
三、双歧杆菌培养基及其作用
1. 双歧杆菌培养基
双歧杆菌培养基主要用于双歧杆菌分离和计数。
其设计特点：
提供丰富氮源和碳源；
添加选择性成分抑制杂菌；
适合双歧杆菌厌氧生长。
典型培养条件：
36℃±1℃；
厌氧培养；
48h±2h。
2. PYG培养基
PYG培养基是一种常用于厌氧菌培养的基础培养基，可用于双歧杆菌生理特性研究。
主要作用：
支持厌氧菌生长；
用于菌株活化和代谢研究。
四、双歧杆菌菌种鉴定方法
1. 分离培养
纯菌菌种：
将菌液或冻干菌粉复溶后接种于双歧杆菌培养基平板。
食品样品：
称取25 g（mL）样品，加入225 mL稀释液，制备1:10样品匀液，然后进行培养分离。
培养条件：
36℃±1℃；
厌氧培养；
48h±2h。
五、形态学及染色鉴定
双歧杆菌主要具有以下形态特征：
| 特征 | 表现 |
|---|---|
| 革兰染色 | 阳性 |
| 芽孢 | 无 |
| 动力 | 无 |
| 抗酸性 | 阴性 |
| 细胞形态 | 杆状、短杆状、球杆状 |
| 特殊形态 | 可出现Y型、V型分叉结构 |
双歧杆菌名称来源于其典型的分叉形态，但不同菌种、不同培养条件下形态变化较大，因此仅依靠显微形态不能完成准确鉴定。
六、生化鉴定
双歧杆菌通常具有以下生化特点：
过氧化氢酶阴性；
不产生芽孢；
能利用多种糖类进行发酵。
常用鉴定项目包括：
糖发酵试验；
七叶苷利用试验；
其他生化反应。
由于不同双歧杆菌种之间生化特征存在差异，因此通常需要结合多项试验进行判断。
目前实际检测中，也常结合：
自动微生物鉴定系统；
MALDI-TOF质谱；
16S rRNA测序。
提高菌种鉴定准确性。
七、有机酸代谢产物分析
双歧杆菌发酵糖类主要产生：
乙酸；
乳酸。
通过气相色谱法（GC）检测有机酸组成，可辅助判断双歧杆菌特征。
双歧杆菌具有典型的：
乙酸/乳酸代谢比例特征
不同菌种产生的有机酸比例存在一定差异，因此可作为菌种鉴定的辅助依据。
检测流程通常包括：
菌株培养；
发酵液处理；
有机酸提取；
气相色谱检测。
八、食品中双歧杆菌计数方法
1. 样品制备
食品样品：
固体样品称取25 g；
液体样品取25 mL。
加入225 mL稀释液，制备1:10样品匀液。
随后进行十倍系列稀释。
2. 平板计数
选择适宜稀释度：
吸取1 mL样品液加入无菌平皿。
加入15～20 mL冷却至约46℃的双歧杆菌培养基。
混匀凝固后：
36℃±1℃；
厌氧培养；
48h±2h。
培养后统计菌落数量。
3. 菌落计数要求
一般选择：
30～300 CFU/平板
范围内的平板进行计数。
计算结果：
固体食品：
CFU/g液体食品：
CFU/mL
如果所有平板均无菌落生长，应按照检测限进行报告，而不能直接报告为0。
九、双歧杆菌检测中的质量控制
双歧杆菌检测对培养条件敏感，实验过程中需要重点控制：
1. 厌氧环境
双歧杆菌对氧敏感，培养过程中应保证：
培养基预还原；
厌氧培养条件稳定；
操作过程减少氧暴露。
2. 培养基性能
培养基需要同时满足：
支持双歧杆菌快速恢复；
保持选择性；
减少乳杆菌、链球菌等其他乳酸菌干扰。
3. 菌落确认
由于部分乳酸菌形态相似，仅依靠平板菌落颜色和形态容易出现误判，因此建议结合：
革兰染色；
过氧化氢酶试验；
糖发酵试验；
分子鉴定方法。
十、总结
双歧杆菌检测主要包括培养计数和菌种鉴定两个方面。
其中：
双歧杆菌培养基用于菌株分离和活菌计数；
厌氧培养是保证检测准确性的关键；
革兰染色、生化试验和有机酸分析可用于菌种确认；
气相色谱分析能够辅助评价双歧杆菌代谢特征。
随着益生菌食品和功能性食品的发展，建立准确、稳定的双歧杆菌检测体系，对于产品质量控制、菌株筛选及研发评价具有重要意义。逗点生物提供双歧杆菌培养基、厌氧培养相关产品及食品微生物检测培养基体系，满足益生菌产品研发和质量控制需求。
