沉降菌监测：洁净环境中空气微生物的被动监测方法

沉降菌监测是洁净室（区）微生物环境监测的重要方法之一，常用于评价空气中微生物粒子在自然沉降条件下对关键操作区域、设备表面和产品暴露面的潜在污染风险。与浮游菌主动采样不同，沉降菌监测不依赖采样泵，而是利用空气中携带微生物的粒子自然降落到培养基平板表面，经培养后形成可见菌落，并以 CFU/碟或 CFU/规定暴露时间表示结果。

沉降菌监测不能直接反映单位体积空气中的微生物数量，但能较好模拟开放操作过程中微生物沉降到产品、容器或关键表面的风险。因此，在无菌生产、洁净区确认和日常环境监测中，沉降菌具有重要的趋势监控价值。

一、沉降法的基本原理

沉降法是将已制备好的培养皿打开并暴露于规定位置，使空气中的含菌粒子在重力、气流扰动和人员活动影响下自然沉降到培养基表面。培养后，根据平板上形成的菌落数评价该位置在暴露时间内的微生物沉降污染水平。

沉降菌结果受空气流型、人员活动、开盖时间、培养基水分、平皿放置位置和环境扰动影响较大，因此它更适合用于过程监控和趋势分析，而不宜简单等同于空气中微生物浓度。若需获得单位体积空气中微生物数，应结合浮游菌主动采样。

二、沉降皿和培养基选择

沉降菌监测常使用直径 90 mm、厚度约 15 mm 的培养皿。培养基可根据监测目的选择。大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）常用于细菌及多数环境微生物监测；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）常用于霉菌和酵母菌监测。若监测区域使用消毒剂或存在抑菌残留，可选择含中和剂的环境监测培养基，以减少消毒剂残留对微生物恢复的影响。

培养条件应按标准方法、药典要求或经验证的企业环境监测方案执行。常见做法是 TSA 用于细菌培养，SDA 用于真菌培养；也有实验室采用同一平板分阶段培养或双培养基平行监测，具体应以验证结果和监测目的为准。

三、培养基质量控制

沉降菌监测对培养基质量要求较高，因为环境微生物数量通常很低，任何培养基污染、失水或抑菌残留都可能导致假阳性或假阴性。用于环境监测的培养基应进行外观、pH、无菌性、促生长能力和必要的中和能力检查。

用于洁净区的沉降皿通常需要特别防护。较高洁净级别区域使用的培养基宜采用双层或三层包装，并优先选择终端灭菌产品。若不能采用终端灭菌培养基，使用前应进行充分预培养检查，以降低将外源污染带入洁净区或造成假阳性结果的风险。

培养基表面应平整、无裂纹、无气泡、无明显冷凝水、无干缩和污染。进入洁净区前，应按区域级别逐层去除外包装，避免外包装表面污染进入高级别区域。

四、暴露失水是关键问题

沉降皿在洁净区暴露过程中会持续蒸发失水，尤其在单向流、高换气次数、低湿度或长时间暴露条件下更明显。培养基失水后，表面水分活度下降，可能影响部分受损菌、干燥敏感菌或营养要求较高微生物的恢复，从而导致结果偏低。

为降低失水影响，可使用适合长时间暴露的高装量沉降皿或环境监测专用平板。所谓“高浇注线”本质上是增加培养基装量，使平板在规定暴露时间和后续培养过程中仍能保持足够水分。对于动态连续监测，若单碟不适合长时间暴露，可在同一位置连续更换多个沉降皿，并按方案累计评价。

五、隔离器和 VHP 环境中的沉降皿

在隔离器或使用过氧化氢蒸汽（VHP）灭菌的环境中，沉降皿包装和培养基抗干扰能力尤为重要。若过氧化氢穿透包装或残留转移至培养基表面，采样后可能抑制微生物生长，造成假阴性。

因此，隔离器使用的沉降皿应选择适用于 VHP 环境的专用产品。最内层包装材料应能有效阻隔过氧化氢蒸汽，培养基还应经过相关适用性验证，确认其在实际传递、暴露和培养流程中不会因消毒剂残留影响回收率。

六、监测前准备

沉降菌监测前，应确认洁净室（区）状态、净化空调系统运行状态、温湿度、压差、风速或换气情况。通常应在温度、湿度、压差等环境参数测试或确认后进行微生物采样，避免测试过程对采样结果造成干扰。

采样人员应完成清洁、消毒和规范着装，减少人员带入污染。静态测试时，应限制室内人员数量，并记录人员进入、操作状态和测试起止时间。动态监测更接近实际生产状态，通常更能反映真实污染风险，因此无菌生产环境日常监测应以动态状态为重点。

净化空调系统应充分运行后再采样。单向流区域和非单向流区域所需稳定时间不同，应按标准、验证结果或企业文件执行。采样前还应确认采样点布置图、平皿编号、暴露时间、培养基批号和阴性对照设置。

七、采样点布置

沉降菌采样点应覆盖代表性区域和高风险区域。采样点数量与洁净区面积、级别、工艺风险和历史监测结果有关。原文中“面积 m³”应修正为“面积 m²”。任何小面积洁净区也不宜少于规定的最低采样点数。

采样点通常设置在离地面约 0.8～1.5 m、略高于工作面的高度，以接近实际操作和产品暴露区域。关键设备、灌装点、开口容器、传递口、人员频繁活动位置、气流回流或扰动区域，应根据风险评估增加采样点。

在单向流区域，采样皿放置不应明显干扰关键气流。对单向流送风口或A级保护区，应关注实际产品暴露面和关键操作点，而不是只按房间面积机械布点。

八、采样时间与培养皿数量

沉降菌静态测试常采用较短暴露时间，动态监测则可采用较长暴露时间。动态暴露时间不宜超过培养基经过验证可承受的最长暴露时间，常见上限为 4 h。若工艺操作持续时间较长，可在同一位置连续使用多个沉降皿，以覆盖整个操作过程，并按监测方案进行累计或分段评价。

A级区、关键操作区或无菌隔离系统的采样点通常应更密集，且每个采样点至少设置一个沉降皿。日常监测方案不应只满足最低数量要求，还应结合污染风险、历史趋势和偏差调查结果动态调整。

九、阴性对照和污染控制

每次监测或每个区域宜设置未暴露的阴性对照培养皿。对照皿应与采样皿同批次、同运输、同培养，但不开盖暴露，用于判断培养基、运输和培养过程是否存在污染。若阴性对照出现菌落，应调查培养基、包装、传递、培养箱和操作过程，并谨慎解释本次监测结果。

采样过程中应避免人为污染。开盖和关盖动作应平稳，手臂不应跨越培养基表面；平皿暴露期间应避免不必要走动、说话、剧烈操作或物品移动。采样结束后应及时盖好平皿，倒置或按方法要求放入培养箱培养。

十、结果判断与A级限度理解

沉降菌结果通常以 CFU/碟/暴露时间表示，并按洁净级别、监测状态和企业批准限度进行判定。每个采样点的结果应低于相应限度，同时还应结合历史趋势、菌种鉴定和位置风险判断。

A级区的限度常写作“＜1 CFU/碟”或“无菌落”。由于菌落数是整数，“＜1 CFU”在实际判读中通常意味着该沉降皿应为 0 CFU。若 A级关键区任一沉降皿出现 1 CFU，即使多个平皿平均值仍小于 1，也不宜简单判为合格，而应至少作为警戒或偏差事件进行调查，必要时采取纠偏措施。

例如，同一 A级关键区域设置 3 个沉降皿：

因此，A级区结果判读不能只看平均数，更要看是否出现任何微生物检出、检出位置是否关键、是否重复出现以及分离菌类型是否与人员、环境或工艺相关。

十一、超限和异常结果处理

当某测点沉降菌结果超过评定标准或企业限度时，应启动调查。调查内容包括采样操作、培养基批号、阴性对照、培养条件、暴露时间、人员活动、HVAC 状态、清洁消毒记录、近期维修或干预、相邻监测点结果以及历史趋势。

静态测试中若某测点超限，可按标准或企业程序重新采样确认。但对无菌生产动态监测中的关键点异常，不能只依靠复测否定原结果，因为原结果可能真实反映了生产过程中的污染事件。对于A级和关键B级区域，应结合风险评估确定是否需要产品影响评估、环境再清洁、人员再培训、菌种鉴定和趋势分析。

十二、沉降菌监测的局限性

沉降菌法简单、直观、成本较低，能反映一定时间内微生物向表面沉降的风险。但它也有明显局限：不能定量空气体积中的微生物浓度；对小粒径、长时间悬浮的微生物粒子捕获效率有限；受气流、暴露时间和培养基失水影响较大；低水平污染时结果波动明显。

因此，沉降菌监测应与浮游菌、表面微生物、人员监测、悬浮粒子监测、压差和气流确认等项目配合使用，形成完整的洁净环境微生物控制体系。

十三、小结

沉降菌监测通过自然沉降方式收集空气中的含菌粒子，是洁净室（区）微生物环境监控的重要方法。监测中应关注培养基质量、包装防护、暴露失水、采样点布置、采样时间、阴性对照和结果趋势。TSA 可用于细菌及一般环境微生物监测，SDA 可用于霉菌和酵母菌监测；隔离器和 VHP 环境应使用经验证的专用沉降皿。A级区结果应按高风险原则理解，任何菌落检出都应引起调查，不能简单依赖多碟平均值掩盖单点阳性。沉降菌监测的价值不在于单次数据本身，而在于与浮游菌、表面菌和人员监测共同反映洁净环境的微生物控制状态。