表面微生物监测：接触碟法与擦拭法的应用要点

表面微生物监测是洁净室、微生物实验室和无菌生产环境监控的重要组成部分。其目的在于评估关键表面是否存在活微生物污染，包括工作台面、设备表面、工具、容器外壁、层流工作区、隔离器内表面以及人员洁净服、手套、口罩等。与空气微生物监测相比，表面监测更直接反映微生物是否已经沉积或转移到可能接触产品、物料或关键操作区域的表面。

表面微生物监测常用方法包括接触碟法和擦拭法。前者适合平整、规则表面，后者适合不规则表面、缝隙、管道、边角和难以直接接触的位置。两种方法互为补充，不能简单互相替代。

一、表面微生物监测的目的

表面微生物监测主要用于评价清洁消毒效果、人员操作污染风险、设备表面卫生状态和洁净区微生物控制水平。对于无菌生产或高洁净级别区域，表面监测还能帮助发现污染来源和趋势变化，例如人员手套污染、设备清洁死角、物料传递污染或消毒剂使用不当等。

监测对象通常包括三类：第一类是关键操作表面，如层流工作台、灌装区域、操作台面和隔离器内表面；第二类是设备和器具表面，如集菌仪、传递窗、工具、管道接口等；第三类是人员表面，如手套、前臂、胸部、口罩、护目镜、靴套等。

表面监测通常应在操作结束后进行，避免采样过程干扰生产或实验操作，同时也更能反映实际操作后的污染状态。

二、接触碟法的原理与适用范围

接触碟法是将表面略凸、充满规定琼脂培养基的接触碟直接压在待测表面，使表面微生物转移至培养基上，经培养后计数菌落。结果通常以 CFU/碟表示。

接触碟常用直径约 55 mm 的培养皿，取样面积约 25 cm²。原文中“直径 55 cm”为明显错误，应修正为 55 mm。接触碟适用于平整、干燥、规则的表面，如实验台面、洁净工作台、设备外表面、洁净服局部表面和手套表面。

接触碟法操作简单、结果直观、重复性较好，适合日常环境监测和人员监测。但对于弧面、粗糙面、狭缝、管道内部、螺纹接口等位置，接触碟难以充分贴合，此时应采用擦拭法。

三、接触碟培养基与包装要求

接触碟培养基通常使用 TSA，也可根据监测目的选择 SDA 或含中和剂的环境监测培养基。TSA 适用于细菌及多数环境微生物恢复；SDA 适用于霉菌和酵母菌监测；含中和剂培养基适用于可能有消毒剂残留的表面。

接触碟培养基应具有良好的弹性、持水性和表面完整性。培养基过软容易破损，过硬则与表面接触不充分；表面过湿会造成水膜扩散和菌落蔓延，过干则会降低微生物回收率。商品化接触碟通常采用双层或三层包装，并经终端灭菌或适当无菌保障处理，以降低带入洁净区污染的风险。

若监测环境中存在抗生素粉尘或特定抑菌物质，可根据需要在培养基中加入相应中和成分，例如青霉素酶用于中和β-内酰胺类抗生素残留。但这类添加剂必须经过方法适用性验证，确认其既能中和残留抑菌物质，又不会抑制目标微生物生长。

四、消毒剂残留与中和剂

表面微生物监测常遇到消毒剂残留问题。洁净室中常使用醇类、季铵盐、含氯消毒剂、过氧化物、酚类、醛类或其他消毒剂。若采样表面残留消毒剂，被接触碟或拭子带入培养基后，可能继续抑制微生物生长，导致假阴性或菌落数偏低。

为降低这种影响，环境监测培养基中常加入中和剂。常见中和剂包括卵磷脂、聚山梨酯 80、组氨酸、硫代硫酸钠等。不同中和剂针对的消毒剂类型不同：

中和剂组合应根据现场消毒剂种类选择，并通过回收率试验证明有效。不能简单认为“加了中和剂就一定不会受消毒剂影响”。

五、接触碟法操作要点

接触碟使用前应从冷藏条件恢复至室温，避免冷凝水影响菌落分布。进入洁净区时，应按区域级别逐层去除外包装，最后一层包装在使用区域打开，以减少外包装带入污染。

采样时打开接触碟上盖，使培养基表面平稳接触待测表面。必要时可轻压接触碟底部中心，使培养基与表面充分接触，接触时间通常应按方法或企业程序固定。取样后应轻轻抬起，避免培养基表面被拖动造成涂抹效应。随后立即盖好皿盖，并在磨砂区域或标签上记录取样位置、时间、编号和采样人。

采样后，应使用规定消毒剂或杀孢子剂清理被采样区域，去除培养基残留，避免营养物质残留在洁净表面上造成后续污染风险。

六、擦拭法的原理与适用范围

擦拭法是使用无菌拭子在规定面积的表面上进行擦拭，将表面微生物转移到拭子上，再将拭子置于缓冲液、稀释液或培养基中洗脱，最后通过平板涂布、倾注、滤膜法或其他方法计数。

擦拭法适用于接触碟难以取样的位置，如管道内部、阀门、接口、弧面、粗糙表面、设备缝隙、边角、凹槽和小面积不规则表面。它的灵活性较高，但回收率受擦拭力度、角度、面积、拭子材料、湿润液和洗脱效率影响较大，因此更需要方法验证。

七、擦拭法操作要点

擦拭前应使用无菌模板或标尺确定取样面积。常见湿润液包括无菌生理盐水、0.1%蛋白胨水、磷酸盐缓冲液或含中和剂的缓冲液。若采样表面可能有消毒剂残留，应优先选择经验证的中和稀释液。

操作时，将无菌拭子头部浸湿后，在管壁上挤去多余液体，避免液滴流动扩大采样面积。擦拭时可使拭子与表面保持一定角度，按横向、纵向和斜向等方向反复擦拭规定区域，并在擦拭过程中转动拭子，使各面充分接触表面。擦拭后将拭子头放入洗脱液中，充分振荡或涡旋，使微生物尽量释放到液体中。

洗脱液可采用涂布法、倾注法或膜过滤法计数。若预计菌数较低，可采用膜过滤法提高检出能力；若样品中可能含有较多颗粒或抑菌残留，应根据验证结果选择合适方法。

八、接触碟法与擦拭法比较

在环境监测方案中，接触碟法和擦拭法应按风险区域组合使用。平整表面优先使用接触碟法，不规则表面采用擦拭法补充。

九、人员表面监测

人员是洁净环境中最重要的微生物污染来源之一。人员表面监测常包括手套、手腕附近袖口、前臂、胸部、肩部、口罩外表面、护目镜、腿部和靴套等位置。具体取样部位应根据操作姿势、人员干预频率和风险评估确定。

对于无菌生产关键区域，人员监测通常在操作结束或人员退出前进行。若关键部位检出微生物，应结合菌落数量、微生物种类、操作记录和历史趋势进行调查。手套、前臂和口罩等接近关键操作区域的部位，检出结果通常具有较高风险意义。

十、限度理解：A级区不应用平均值掩盖阳性

原文中提到 A级“＜1 CFU/碟”，并用多个接触碟平均菌落数判断不合格。这种理解需要修正。由于菌落数是整数，“＜1 CFU/碟”在实际判读中通常意味着该碟应为 0 CFU。对于 A级关键区，任一接触碟出现 1 CFU 都不应简单通过多个部位平均值降低风险，而应按警戒、偏差或纠偏程序处理。

例如，某人员监测 4 个部位：左前臂、右前臂、前胸、口罩外表面。若结果为 1、0、0、0，平均值为 0.25 CFU/碟，但该结果仍提示至少一个关键人员表面存在微生物污染，不宜直接判为合格。若结果为 0、0、0、0，才符合 A级区“无检出”的实际控制逻辑。

A级区和无菌关键操作区的表面微生物监测，应更关注“是否检出”和“检出位置”，而不是单纯依赖平均值。

十一、方法验证与回收率

表面微生物监测方法应进行适用性验证，尤其是擦拭法和含中和剂培养基。验证内容包括取样表面代表性、消毒剂中和效果、微生物回收率、培养基促生长能力、洗脱效率和方法重复性。

验证菌株除标准质控菌外，还应考虑环境中分离的代表菌。因为洁净环境中的实际污染菌可能处于干燥、消毒剂应激或低营养状态，回收难度高于实验室标准菌株。若方法不能有效回收现场代表菌，日常监测结果可能低估真实污染水平。

十二、常见问题与注意事项

第一，表面微生物监测应尽量在操作结束后进行，避免采样过程污染产品或干扰生产。

第二，接触碟应恢复至室温后使用，防止冷凝水影响菌落形态。

第三，采样时应避免滑动接触碟，否则会造成菌落拖痕和计数误差。

第四，采样后必须清洁取样区域，去除培养基残留。

第五，消毒剂残留可能导致假阴性，必要时使用含中和剂培养基或中和稀释液。

第六，擦拭法必须明确采样面积、擦拭方向、洗脱体积和计数方法。

第七，人员监测结果应结合操作行为和取样部位解释，不宜只看总数。

第八，超限或趋势异常应进行菌种鉴定和污染来源调查。

十三、小结

表面微生物监测用于评价洁净室、设备、实验台面和人员表面的活微生物污染水平，是环境监控体系的重要组成部分。接触碟法适用于平整规则表面，结果直观、操作简便；擦拭法适用于不规则表面、缝隙、管道和难接触区域，是接触碟法的重要补充。监测中应重点控制培养基质量、中和剂有效性、采样方式、人员操作和方法验证。对于 A级关键区，任何接触碟或关键表面检出菌落都应引起关注，不能用多个部位平均值掩盖单点阳性。表面微生物监测的真正价值在于发现污染来源、评估清洁消毒效果，并通过趋势分析持续改进洁净环境控制水平。