GB 4789.15—2016 霉菌和酵母计数的变化及解读

GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》规定了食品中霉菌和酵母的计数方法。该标准第一法适用于各类食品中霉菌和酵母的计数，第二法主要适用于番茄酱罐头、番茄汁等样品中霉菌的计数。与 2010 版相比，2016 版在设备材料、稀释液、培养基制备、培养方式、计数规则和报告方式等方面进行了调整，使方法更贴近实验室实际操作，也使结果判定更加清晰。

需要注意，霉菌和酵母计数不同于普通菌落总数计数。霉菌菌落可能蔓延、产孢、相互覆盖，酵母菌落则常呈圆形、湿润、酵母样。培养时间长、菌落形态差异大，是该项目比细菌计数更容易出现判读差异的主要原因。

一、设备和材料的变化

2016 版对部分设备名称和规格进行了明确。均质器表述更具体，强调可使用拍击式均质器或均质袋。这样做的意义在于减少旋转刀式均质对霉菌菌丝的破坏。霉菌常以菌丝、孢子团或片段形式存在，过度机械切割可能改变菌落形成单位，影响计数结果。拍击式均质更适合多数食品微生物样品的均质处理。

无菌试管规格由小规格改为较大规格，有利于样品稀释液充分混匀。霉菌孢子和菌丝片段在稀释液中容易分布不均，若试管过小、混匀不足，平板间差异会增大。

2016 版还增加了微量移液器及吸头、漩涡混合仪和恒温水浴。微量移液器更符合现代实验室操作习惯；漩涡混合仪可提高稀释液混匀效率，减少反复吹吸带来的污染和气溶胶风险；恒温水浴可稳定控制倾注培养基温度，避免温度过高损伤菌体或温度过低导致琼脂提前凝固。

二、稀释液的变化

2010 版主要使用无菌蒸馏水作为稀释液，2016 版增加了生理盐水和磷酸盐缓冲液。这样更方便实验室对同一份样品同时开展菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母等项目检测，也有利于提高不同项目样品前处理的一致性。

原资料中“生理盐水：85 g 氯化钠加入 1000 mL 蒸馏水”应修正为 8.5 g 氯化钠加入 1000 mL 水，即 0.85% 氯化钠溶液。若误配成 85 g/L，将形成高盐环境，可能抑制部分微生物并影响检测结果。

磷酸盐缓冲液的作用是维持稀释体系 pH 稳定。对于酸性、碱性或缓冲能力较弱的样品，使用缓冲液有助于减少样品基质对霉菌和酵母恢复的影响。

三、培养基制备的变化

2016 版对马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和孟加拉红琼脂的灭菌条件作了调整，灭菌时间由原来的较长时间缩短为常规灭菌时间。其主要考虑是：含糖培养基长时间高温处理可能导致糖类降解、焦糖化或 pH 变化，从而影响霉菌和酵母的生长及菌落形态。

PDA 是霉菌和酵母计数中常用的营养培养基，适合多种真菌生长；孟加拉红琼脂则通过孟加拉红和抗菌成分限制霉菌蔓延、抑制细菌干扰，使菌落更便于计数。不同培养基回收的菌群可能不同，实验室应按标准要求选择，并保证培养基质量控制合格。

四、氯霉素加入方式的变化

旧版操作中曾涉及将氯霉素用少量乙醇溶解后加入培养基的步骤。2016 版删除该繁琐步骤，使操作更简化。氯霉素用于抑制细菌生长，减少细菌对霉菌和酵母计数的干扰。

但需要注意，氯霉素虽然可用于抑菌，但并不意味着所有样品都可随意调整抗生素浓度。抗生素浓度过高可能影响部分酵母或真菌恢复，浓度过低则可能导致细菌干扰。培养基配制应按标准或产品说明执行，并进行必要的质量控制。

五、倾注平板培养基用量增加

2016 版将每皿培养基使用量由 15～20 mL 调整为 20～25 mL。这一变化与霉菌和酵母培养时间较长有关。培养基量增加后，平板厚度增加，保水性更好，可减少培养过程中失水、干裂和营养浓缩对菌落形成的影响。

霉菌和酵母培养通常需要较长时间，若培养基过薄，容易出现表面干燥，影响菌落大小和孢子形成，也可能使部分菌落难以准确计数。因此，培养基厚度和水分保持是霉菌酵母计数中不可忽视的质量因素。

六、培养方式由倒置改为正置

2016 版增加了平板正置培养的规定。这一点与霉菌培养特点密切相关。霉菌培养过程中可能产生孢子，若反复倒置、翻转或观察时动作过大，孢子可能散落到平板其他部位，形成次生小菌落，造成计数偏高或菌落来源不清。

正置培养有助于减少反复翻转造成的孢子扩散。实际观察时，也应尽量减少平板开盖和移动，必要时从平皿底部或侧面观察菌落形态。若霉菌已经明显产孢或蔓延，应更谨慎判读。

七、菌落蔓延的报告更加明确

2016 版明确了霉菌蔓延生长覆盖整个平板时，可记录为“菌落蔓延”。旧版中若简单报告为“多不可计”，容易造成理解偏差。霉菌蔓延并不一定代表菌落数量过多，也可能由少数强蔓延菌落覆盖平板导致。因此，“菌落蔓延”比“多不可计”更能准确描述平板状态。

对于蔓延明显的样品，实验室应结合稀释度、培养基类型和观察时间判断是否需要重新检测或选择更合适的稀释度。若样品中蔓延性霉菌较多，孟加拉红琼脂等限制蔓延培养基可能更有利于计数。

八、计数范围和计算规则更完善

GB 4789.15—2016 规定霉菌和酵母计数通常选择菌落数在 10～150 CFU 范围内的平板。与细菌菌落总数常用 30～300 CFU 不同，霉菌菌落体积大、形态不规则、易蔓延，因此适宜计数范围更低。

2016 版补充了两个连续稀释度均在适宜范围内时的计算方法，可参照 GB 4789.2 的相关公式进行计算。同时也明确了所有稀释度均不完全处于适宜范围时的处理原则，即选择最接近适宜范围下限或上限的平均菌落数乘以稀释倍数进行估算。

此外，若空白对照平板出现菌落，本次检测结果无效。这一规定非常重要。霉菌孢子容易随空气、器具或操作过程污染平板，空白对照长菌说明培养基、环境或操作存在污染风险，不能继续使用该批结果评价样品。

九、结果报告方式的变化

2016 版对结果报告方式作了进一步细化。菌落数较低时，报告方式应避免产生虚假的精确度。原资料提到“菌落数在 10 以内时采用一位有效数字报告”，其目的就是防止把低菌落数结果修约成看似精确的两位数字。

霉菌和酵母计数结果通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。若样品称重检测，则以 CFU/g 报告；若按体积取样，则以 CFU/mL 报告。若低于检出限，应按方法检出限报告为“小于某值”，不应简单写“0”。

十、第二法的定位

GB 4789.15—2016 的第二法主要用于番茄酱罐头、番茄汁等样品中霉菌的计数。原资料中提到“郝氏计测玻片”的相关表述，应理解为该法中的显微计数思路，主要用于特定样品的霉菌污染评价。

第二法并不是普通食品霉菌和酵母计数的替代方法。对于多数食品，应优先按第一法进行平板计数；只有在标准规定适用范围内，才使用第二法。

十一、2016 版仍需注意的技术问题

虽然 2016 版较 2010 版更完善，但在实际执行中仍有一些需要注意的问题。

第一，霉菌和酵母菌落形态区分具有一定主观性。酵母菌落多为圆形、湿润、光滑、酵母样；霉菌菌落常呈绒毛状、棉絮状、粉末状或放射状。但部分酵母可形成假菌丝，部分霉菌早期菌落较小，二者并不总是容易区分。

第二，培养 5 d 期间应关注菌落蔓延风险。霉菌可能从第 3 d 开始明显扩散，若不及时观察，后期可能覆盖平板，影响计数。实际操作中可在不影响培养条件的前提下进行阶段性观察，并记录蔓延趋势。

第三，培养温度对检出菌群有影响。我国标准采用 28℃左右培养，而部分国际方法使用略低培养温度。不同温度可能影响霉菌和酵母的生长速度、菌落大小和检出谱，因此跨方法比较时应谨慎。

十二、历代版本变化概览

需要特别纠正的是，原资料表格中的 “GB/T 4879.15” 和 “GB 4879.15” 均应更正为 GB 4789.15。

十三、常见误区

第一，霉菌和酵母计数不能照搬细菌菌落总数的 30～300 CFU 范围，GB 4789.15—2016 的适宜计数范围为 10～150 CFU。

第二，生理盐水不是 85 g/L 氯化钠，而是 8.5 g/L 氯化钠。

第三，霉菌平板正置培养不是形式变化，而是为减少孢子扩散和次生菌落。

第四，菌落蔓延不等于多不可计，应按“菌落蔓延”描述平板状态。

第五，空白对照有菌落时，检测结果无效，不能继续报告样品结果。

第六，霉菌和酵母分别计数时，应结合菌落形态和必要的镜检，不宜仅凭颜色或大小判断。

十四、小结

GB 4789.15—2016 相比 2010 版，在设备材料、稀释液、培养基制备、平板培养方式、计数范围、结果计算和报告规则方面均更加细化。主要变化包括明确拍击式均质器或均质袋，增加生理盐水和磷酸盐缓冲液，调整培养基灭菌和倾注要求，增加正置培养，明确菌落蔓延记录，并完善低菌落数和特殊情况下的计算报告规则。这些变化的核心目的，是提高霉菌和酵母计数的可操作性、可比性和结果可靠性。实际执行中，应重点关注培养基质量、样品均质、稀释液选择、平板水分保持、菌落形态区分和空白对照控制，避免因操作细节造成计数偏差。