如何正确制备微生物检测培养基？

培养基是微生物检测的基础。培养基配制是否准确，直接影响目标菌能否生长、非目标菌能否被抑制、典型反应是否清晰，以及最终检测结果是否可靠。对食品微生物实验室而言，培养基制备不只是“称量、溶解、灭菌”几个步骤，更是一项需要受控记录、质量检查和性能验证的关键过程。

食品微生物检验用培养基和试剂的质量控制，应关注 GB 4789.28—2024《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》。该类标准的核心思想是：培养基不仅要外观正常、pH 合格、无菌，还要通过适宜的质控菌株验证其促生长能力、选择性和特异性。

一、配制前准备：先确认配方和用途

培养基配制前，应先确认检测项目、培养基名称、标准依据、配制体积、批号、有效期和特殊添加剂要求。商品化脱水培养基应按说明书和对应标准执行；自配培养基则应按标准配方、实验室验证过的配方或经批准的文件执行。

配制前还应检查原料状态。脱水培养基若出现结块、吸潮、颜色异常、异味或超过有效期，不宜直接使用。含显色底物、抗生素、胆盐、染料、糖类或选择性抑制剂的培养基，对储存和加热条件更敏感，应重点核查。

培养基配制用水应符合微生物检验要求。水中若含有抑菌物质、余氯、重金属、过高电导率或微生物污染，可能影响培养基性能。实验室应对制备用水进行周期性监控。

二、称量：准确但不过度机械

培养基称量应根据配制量和允许误差选择合适天平，不能一律规定为“精确到 0.01 g”。少量添加剂、抗生素、染料和指示剂可能需要更高精度天平；大批量基础培养基则应使用量程和精度匹配的天平。

称量时应注意以下几点：

称量纸可用于普通粉末短时间称量，但对吸潮性强、带静电、易污染或贵重微量成分，不一定适合。必要时可使用称量舟、玻璃器皿或专用称量容器。

三、溶解：避免结团、焦化和成分失活

培养基溶解应按配方特点进行。一般先加入约 80% 的配制用水，边搅拌边加入粉末，待充分分散后再补足体积。含琼脂培养基需要加热至琼脂完全溶解；不含琼脂的液体培养基通常不需要长时间煮沸。

加热溶解时应持续搅拌，避免底部焦化。焦化会改变培养基颜色、pH 和营养成分，还可能产生抑菌物质。若出现明显焦化、沉淀异常或颜色异常，应重新配制。

培养基不宜使用可能释放金属离子或与成分反应的容器。大批量配制宜使用洁净不锈钢容器或适宜的耐热玻璃容器。对容易相互反应生成沉淀的成分，如某些磷酸盐与镁盐、钙盐等，可分开溶解后按规定顺序加入。

四、pH 调整：关注最终 pH

培养基 pH 对微生物生长、选择性和显色反应影响很大。不同培养基有不同 pH 要求，不能统一认为培养基 pH 都应为 7.4～7.6。例如霉菌酵母培养基、乳酸菌培养基、弧菌培养基、沙门氏菌选择性培养基和大肠菌群相关培养基，其 pH 范围各不相同。

pH 测定应优先使用经过校准的 pH 计。精密 pH 试纸只能作为粗略判断，不适合替代关键培养基的最终 pH 测定。pH 计使用前应按要求用标准缓冲液校准，并注意温度补偿、样品温度和电极维护。

需要重点强调的是，培养基 pH 应以灭菌后或最终使用状态为准。高压灭菌、糖类分解、磷酸盐缓冲体系变化、琼脂批次差异和添加剂加入，都可能改变最终 pH。若培养基说明书要求灭菌前调 pH，应按说明执行；若标准要求最终 pH，则应测定灭菌冷却后的培养基。

调 pH 时应使用合适浓度的酸或碱，少量多次加入，充分混匀后再测定。不能直接加入大量浓酸或浓碱，以免局部高浓度破坏培养基成分。

五、过滤和澄清：不是所有培养基都需要

多数商品化培养基溶解后不需要过滤。若培养基本身含有沉淀性成分、指示剂、乳浊成分、碳酸钙或不溶性颗粒，不应盲目追求“完全澄清”。有些培养基的轻微浑浊或沉淀是配方特征，不一定是不合格。

若标准或说明书要求澄清，可采用适当过滤方式。但传统油纸过滤、蛋清澄清等方法不适合作为现代实验室常规操作，因为可能引入外源成分、改变营养组成或影响可重复性。对无菌过滤添加剂，应使用合适孔径的无菌滤膜，并按无菌操作加入已经冷却到适宜温度的基础培养基中。

六、分装：按用途控制装量

培养基分装应根据用途、容器规格和灭菌方式确定。分装量过多会影响灭菌效果和操作安全；分装量过少则可能导致蒸发过多、pH 改变或干裂。

常见分装要求如下：

每批培养基可另取代表性容器用于最终 pH 测定、外观检查和无菌检查。分装后应及时灭菌，避免长时间放置导致污染或成分沉降。

七、灭菌：按培养基特性选择条件

培养基灭菌条件应按标准、说明书或经验证的程序执行，不能简单套用“121℃15 min”。不同培养基对热的耐受性不同，含糖类、显色底物、抗生素、血液、血清、卵黄、亚碲酸盐、维生素和部分选择性添加剂的培养基，往往需要特殊处理。

常见灭菌方式包括：

高压灭菌后应自然降压，不宜过早开盖。含倒管的培养基，如 LST、BGLB 等，应避免倒管内残留气泡。气泡可能来自倒管未预充满、灭菌排气不足、试管塞过紧、降压过快或培养基本身气体释放。

八、热敏添加剂的加入

许多选择性或鉴别性培养基需要在基础培养基灭菌冷却后加入热敏添加剂，如抗生素、卵黄、血液、亚碲酸盐、显色底物、维生素和某些抑菌剂。加入温度通常应控制在不损伤添加剂且培养基未凝固的范围内，一般琼脂培养基常在约 45～50℃时加入，但具体温度应按说明书执行。

加入后应充分混匀，避免局部浓度过高或分布不均。含抑菌剂的添加剂若混匀不充分，可能导致同一批平板选择性不一致，影响目标菌回收率。加入添加剂后应记录名称、批号、加入量、加入时间和操作者。

九、倒平板：控制温度、厚度和污染

倒平板前，应确认培养基已完全融化并冷却至适宜温度。温度过高容易产生大量冷凝水，也可能损伤热敏添加剂；温度过低则容易提前凝固，造成平板厚薄不均或表面颗粒。

倒平板应在洁净受控环境中进行。普通环境中可在无菌操作区操作；若在生物安全柜内操作，不应使用酒精灯明火。培养皿应无菌、干燥、完整。倒入培养基后轻轻旋转，使其均匀铺展，避免产生气泡。

90 mm 平板常见装量约为 15～20 mL，具体应根据方法、培养皿规格和培养基用途确定。选择性分离平板、倾注计数平板、接触碟和特殊培养基对厚度可能有不同要求，应按对应标准执行。

平板凝固后若表面水分较多，可在洁净条件下适当干燥。过度干燥会影响菌落扩散、抑菌剂浓度和目标菌恢复，因此应控制干燥时间和条件。

十、摆斜面：趁热操作，角度一致

试管琼脂培养基灭菌后，应在未凝固前摆放成斜面。斜面长度、底层深度和角度应满足接种用途。斜面过长容易干燥，底层过浅不利于保存；斜面过短则接种面积不足。

摆斜面时应保证试管塞或盖子不被培养基污染，避免培养基流入塞口造成污染风险。凝固后应检查斜面是否平整、有无裂纹、气泡、干缩或异物。

十一、培养基质量检查

培养基制备完成后，必须进行质量检查。检查内容包括外观、颜色、透明度、凝固状态、装量、pH、无菌性和性能测试。

无菌检查不能替代性能测试。某批培养基即使无菌，也可能因 pH、抑菌剂浓度、灭菌过度或成分失活导致目标菌生长不良。对选择性和鉴别性培养基，必须用适宜质控菌株验证。

十二、培养基保存和使用

制备好的培养基应按要求保存。平板培养基通常需避光、密封、防干燥、低温保存，并在规定期限内使用。含血液、卵黄、抗生素、显色底物或挥发性成分的培养基保存期通常更短，应按说明书或实验室验证结果执行。

使用前应检查平板是否干裂、污染、冷凝水过多、颜色异常或超过有效期。选择性培养基若长期放置，抑菌剂可能降解或水分蒸发，导致选择性和促生长能力变化。

十三、常见问题与原因分析

出现异常时，应先停止使用该批培养基，排查称量、配制、pH、灭菌、添加剂、容器、保存和质控菌株状态，并保留调查记录。

十四、常见误区

第一，认为培养基只要灭菌了就能用。灭菌只能证明无菌，不代表性能合格。

第二，所有培养基都按 121℃15 min 灭菌。不同培养基热稳定性不同，应按标准或说明书执行。

第三，pH 灭菌前合格就可以。应关注灭菌后或最终使用状态的 pH。

第四，培养基越清澈越好。有些培养基本身允许轻微浑浊或沉淀，不能盲目过滤。

第五，平板越干越好。过度干燥会影响菌体恢复和培养基浓度。

第六，选择性培养基不用做性能测试。选择性和特异性必须通过质控菌株确认。

第七，商品化培养基不需要质量控制。商品化培养基也应按实验室使用要求进行验收和必要质控。

十五、小结

微生物检测培养基的正确制备，应包括配方确认、准确称量、充分溶解、合理调 pH、按特性灭菌、规范分装、正确倒板或摆斜面，以及最终质量检查。培养基质量控制不仅包括外观、pH 和无菌性，还应包括促生长能力、选择性和特异性评价。对食品微生物实验室而言，培养基制备应符合 GB 4789.28—2024 的质量控制思路，并通过记录和质控菌株验证确保每批培养基适用于检测目的。培养基制备规范，微生物检测结果才有可靠基础。