大肠菌群平板计数法常见问题解析

大肠菌群平板计数法常用于大肠菌群含量较高食品样品的计数。该方法通常以结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）为选择性鉴别培养基，通过典型和可疑菌落计数，再经确认试验计算样品中大肠菌群数量。与 MPN 法相比，平板计数法更直观、便于观察菌落形态，但对培养基制备、平板选择、菌落挑取和结果计算要求较高。

需要注意，GB 4789.3—2016 已被 GB 4789.3—2025 替代。实际检验、报告和实验室作业指导书应以现行标准文本为准，旧版方法资料可作为理解方法逻辑的参考。

一、VRBA 培养基为什么不建议高压灭菌

VRBA 含有胆盐、结晶紫和中性红等选择性与指示成分，过度加热可能影响培养基的选择性、颜色反应和菌落形态。因此，VRBA 通常按标准或产品说明书要求加热煮沸溶解后临用，不宜进行常规 121℃高压灭菌。

但“不高压灭菌”不等于可以降低无菌要求。用于倾注的培养皿、吸管、移液器吸头、稀释液和样品处理器具必须无菌；配制培养基的容器应洁净、干燥、无残留，最好使用适宜的耐热玻璃容器或不锈钢容器。培养基煮沸后若需要短时间放置，应使用灭菌铝箔、无菌瓶盖、灭菌棉塞或其他合适方式防尘保护，不建议用普通卫生纸直接覆盖瓶口。

二、VRBA 煮沸 2 分钟如何理解

VRBA 的加热目的是使培养基充分溶解，并降低杂菌污染风险，同时避免选择性成分和糖类因过度加热而受损。旧文中“煮沸数秒即可”的说法不严谨。实际操作应按标准或产品说明书执行，控制加热时间，避免长时间剧烈沸腾。

加热时建议使用容量足够的容器，培养基装量不宜过满，并边加热边搅拌，防止底部局部过热、焦化或突然喷溅。若出现明显喷涌风险，应立即降低热源或移开容器。大体积配制时，尤其要注意防止暴沸、烫伤和培养基损失。

VRBA 配制后通常要求临用，不宜长时间保温或反复加热。过度加热可能导致颜色变深、pH 改变、胆盐沉淀异常、菌落反应不典型或目标菌恢复率下降。

三、未用完的 VRBA 能否冷藏后下次再用

一般不建议。VRBA 属于临用型培养基，冷却凝固后再次加热熔化，容易发生喷涌、局部过热和成分变化，也可能影响选择性和指示反应。若反复熔融，琼脂结构、pH、胆盐状态和中性红显色效果都可能发生改变。

因此，VRBA 应按当天检测量合理配制，尽量一次用完。若实验室确需对制备后使用时限进行管理，应按标准、说明书和实验室验证结果执行，并做好配制时间、使用时间、外观和质控记录。培养基和试剂质量控制应关注 GB 4789.28—2024 的要求。

四、VRBA 倾注后是否需要覆盖一层

大肠菌群平板计数法中，VRBA 倾注混匀并凝固后，通常还需要再覆盖一层 VRBA。覆盖层的作用主要有三点：一是限制部分菌落蔓延，便于计数；二是增强选择性环境；三是使菌落形态更符合标准判读要求。

覆盖层一般应在底层培养基凝固或半凝固后加入，缓慢倾注至刚好覆盖平板表面即可。覆盖过厚可能影响菌落生长和观察；覆盖过薄则难以抑制蔓延或形成稳定环境。不同标准或产品说明对覆盖层用量可能有规定，实验室应按现行方法文件执行。

旧文中“多数情况下不需要覆盖”的说法不宜作为通用建议。若标准方法要求覆盖，应执行标准；若实验室采用经确认的替代流程，也应有方法确认和记录支持。

五、如何判断 VRBA 上是否为大肠菌群菌落

VRBA 上典型大肠菌群菌落通常表现为红色、紫红色或暗红色，周围可有胆盐沉淀环。其形成原因是大肠菌群发酵乳糖产酸，使中性红指示剂显色，并促使胆盐沉淀。

但 VRBA 上的菌落形态并非绝对。部分非大肠菌群也可能出现红色或类似菌落；部分大肠菌群菌株由于生长状态、食品基质、培养基批次或培养时间不同，菌落形态可能不典型。因此，平板上出现典型或可疑菌落后，不能只凭颜色直接报告，仍需按标准进行确认试验。

对新手而言，建议在训练阶段将不同形态的典型菌落、可疑菌落和干扰菌落分别挑取确认，逐步建立对菌落形态的判断经验。

六、哪些菌落需要做确认试验

平板计数法的核心不是把 VRBA 上所有红色菌落都直接计为大肠菌群，而是先计数典型和可疑菌落，再挑取代表性菌落进行确认。确认培养通常使用 BGLB 肉汤等确认培养基，观察是否产气。产气者可作为大肠菌群阳性确认结果。

菌落挑取应覆盖不同形态类型。如果典型和可疑菌落数量较少，应尽量全部挑取；若数量较多，应按标准要求或实验室作业指导书挑取规定数量，并保证不同形态都有代表性。不能只挑“最像”的菌落，否则会导致阳性比例估计偏差。

BGLB 管在接种前应检查倒管内是否已有气泡。若未接种前已经有气泡，应弃用或重新制备，避免误判为产气阳性。

七、两个连续稀释度都有菌落时如何选择

平板计数应选择适宜计数范围内的平板。GB 4789.3—2016 中常用选择范围为 15～150 CFU。若两个连续稀释度的平板均在适宜范围内，通常应按标准要求综合计算，而不是主观只选一个“看起来合适”的稀释度。

实际操作中，若低稀释度平板菌落较多，高稀释度平板菌落接近下限，应重点关注结果是否符合计数规则、两个稀释度之间是否呈合理倍数关系、平行平板差异是否可接受，以及确认试验挑取是否具有代表性。

若菌落数过多、融合、蔓延、沉淀严重或无法区分典型菌落，应记录为不适宜计数，并选择更合适稀释度或重新检测。

八、确认试验阳性比例如何用于计算

平板计数法通常先计数 VRBA 上典型和可疑菌落总数，再根据确认试验阳性比例修正结果。其基本逻辑是：

经确认的大肠菌群数 = 平板上典型和可疑菌落数 × 确认阳性比例 × 稀释倍数。

例如，某一稀释度平板上计得典型和可疑菌落共 100 个，挑取 10 个进行 BGLB 确认，其中 6 个产气阳性，则该平板经确认的大肠菌群数为：

100 × 6/10 × 稀释倍数。

如果典型菌落和可疑菌落分开计数、分开确认，则可分别计算后相加。例如某平板上可疑菌落 10 个、典型菌落 6 个；可疑菌落挑取 10 个确认阳性 3 个，典型菌落挑取 6 个确认阳性 5 个，稀释倍数为 10，则结果可按以下逻辑计算：

10 × 3/10 × 10 + 6 × 5/6 × 10 = 30 + 50 = 80 CFU/g 或 CFU/mL。

旧文示例中将可疑菌落 10 个乘以 6/10，与其前文“10 个可疑中 3 个阳性”的设定不一致，应更正为 3/10。

九、如果 VRBA 上菌落很多，但确认全部阴性怎么办

如果适宜计数平板上存在大量典型或可疑菌落，但确认试验全部阴性，应首先判断是否存在非目标菌干扰、培养基选择性不足、菌落形态误判或确认培养基问题。必要时可按标准要求从更低稀释度或其他代表性平板上补充挑取不同形态菌落确认。

若经过规定确认后仍全部阴性，则不应把 VRBA 上的可疑菌落报告为大肠菌群。此时应按标准关于未检出或低于检出限的要求报告，并注明方法和稀释关系。常见表达思路为小于最低可报告限，例如最低检测稀释度对应 10 倍稀释时，可报告为 <10 CFU/g 或 <10 CFU/mL，具体应按现行标准和实验室报告规则执行。

需要注意，不能因为 VRBA 上“看起来长了很多红色菌落”就忽略确认结果。大肠菌群平板计数法最终报告的是经确认的大肠菌群数，而不是 VRBA 上所有疑似红色菌落数。

十、VRBA 平板常见异常及原因

十一、培养基和试剂质控不能忽略

VRBA、BGLB 等培养基应按培养基质量控制要求进行验收和性能评价。培养基不仅要外观正常、pH 合格、无明显污染，还应能支持目标菌典型生长，并对非目标菌具有规定抑制效果。

对商品化脱水培养基，也不能认为“厂家合格就无需实验室质控”。实验室至少应按标准、说明书和内部质控计划进行批次验收、储存检查、配制记录、pH 检查和必要的质控菌株验证。

培养基失控会直接影响结果：选择性过强可能导致目标菌生长弱或假阴性；选择性过弱可能导致非目标菌大量生长；指示系统异常会造成菌落颜色不典型，增加确认试验负担。

十二、常见误区

第一，认为 VRBA 不高压灭菌，所以配制过程可以不注意无菌。实际上，平皿、吸管、稀释液和防尘保护都必须受控。

第二，认为煮沸几秒就足够。VRBA 应按标准或说明书加热溶解，避免不足或过度加热。

第三，认为未用完的 VRBA 可以冷藏后反复使用。反复熔融容易影响培养基性能和安全操作。

第四，认为 VRBA 上红色菌落就是大肠菌群。典型和可疑菌落需经确认试验。

第五，挑取菌落只挑最典型的。确认试验应覆盖不同形态，否则阳性比例可能失真。

第六，BGLB 管接种前有气泡仍继续使用。初始气泡会影响产气判读。

第七，确认全部阴性仍按疑似菌落数报告。最终结果应以确认结果为依据。

第八，标准更新后仍沿用旧版记录和计算规则。GB 4789.3—2025 已实施，应及时更新作业指导书和报告模板。

十三、小结

大肠菌群平板计数法看似简单，实际关键点集中在 VRBA 培养基制备、覆盖层操作、平板选择、典型和可疑菌落确认、阳性比例计算以及结果报告。VRBA 不建议高压灭菌，但制备和倾注过程仍需严格控制污染；培养基应临用制备，避免反复熔融；平板上疑似菌落必须通过确认试验修正计算。GB 4789.3—2025 已代替 GB 4789.3—2016，食品微生物实验室应以现行标准为依据，及时更新操作文件、质控要求和结果报告规则。