菌落总数测定中的注意事项

菌落总数是食品微生物检验中最常用的卫生指示指标之一。它反映的是食品样品经过处理后，在规定培养基、培养温度和培养时间等条件下形成的可计数菌落总数。需要注意，菌落总数并不等于样品中“所有活菌数”，也不等于“全部微生物数量”，而是特定方法条件下可生长并形成菌落的微生物数量。

在食品检验中，菌落总数测定常用于评价原料污染程度、加工卫生状况、热处理效果、包装和贮运控制水平。检测结果是否可靠，取决于样品代表性、稀释操作、培养基温度、倾注时间、培养条件、计数规则和空白对照等多个细节。

一、菌落总数结果的正确理解

菌落总数通常采用平板计数法，以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。CFU 是 colony-forming unit，即菌落形成单位。一个菌落可能来自一个细胞，也可能来自一团细胞、一个菌块或一段菌丝，因此不能简单理解为“一个菌落等于一个细菌”。

GB 4789.2 方法条件下测得的菌落总数，主要反映能在平板计数琼脂等培养基上、规定需氧培养条件下生长的微生物。严格厌氧菌、受损后不能恢复的菌、特殊营养需求菌、低温菌、嗜热菌、霉菌和酵母等，若不适应该方法条件，可能不会被充分计入。

因此，菌落总数是一个方法学指标，而不是样品微生物总量的绝对值。

二、样品稀释：代表性和时间控制是关键

样品检测前应根据产品类型、污染水平和标准要求选择合适稀释度。通常选择 2～3 个连续稀释度，以保证至少有一个稀释度平板落入适宜计数范围。若样品污染水平未知，稀释范围应适当放宽，避免所有平板均过多或过少。

样品制备时应充分均质。液体样品应混匀后取样；固体、半固体或含颗粒样品应按标准加入稀释液后均质。高脂、高糖、高盐、粉末、坚果、乳粉等样品易出现分散不均，应特别注意均质效果。

从样品匀液制备到接种完成，应尽量缩短时间。时间过长可能导致细菌增殖、沉降、附着或样液干燥，从而影响菌落分布和计数准确性。

三、倾注培养基的温度和厚度

倾注平板时，培养基温度是影响结果的重要因素。温度过高可能损伤受热敏感或亚致死状态的微生物；温度过低则琼脂可能提前凝固，导致样液与培养基混合不均，形成片状菌落或菌落分布异常。

平板计数琼脂一般应在适宜温度下倾注，并尽快与样液混匀。混匀时可先按一个方向轻轻旋转，再反方向旋转，使样液均匀分布。旋转时应避免培养基溅到皿盖、皿边上方或形成气泡。

平板厚度也会影响菌落生长。90 mm 平皿常见培养基用量约为 15～20 mL。培养基过薄，培养过程中水分蒸发明显，可能影响菌落大小和恢复；过厚则凝固慢、耗材多，也可能影响观察。

四、平板凝固和培养

培养基凝固后，应按标准要求及时倒置培养。倒置培养可以减少冷凝水滴落到培养基表面，降低菌落蔓延和融合风险。平板不宜在室温长时间放置，尤其是样液已经加入但未及时倾注或培养时，容易造成菌体附着、局部聚集或片状生长。

培养温度和时间应按现行方法标准或产品标准执行。不同食品、不同检测目的和不同微生物群体，对培养条件的要求可能不同。旧资料中简单写“食品 36℃、饮用水 36℃、水产品 30℃”不宜作为通用规则。食品样品应按食品微生物检验方法执行；饮用水、包装饮用水或天然矿泉水应按对应水质或产品检验标准执行。

五、空白对照和环境污染控制

菌落总数测定必须设置空白对照。空白对照可帮助判断稀释液、培养基、平皿、吸管、吸头或操作环境是否存在污染。若空白对照有菌落生长，应评估本次检测结果有效性，必要时重新检测。

在实际操作中，还可根据实验室质量控制要求设置环境暴露平板，用于判断操作过程中是否存在明显空气沉降污染。但环境暴露平板不能替代样品空白对照，也不能作为结果修正依据。

常见污染来源包括：稀释液灭菌不彻底、培养基污染、平皿包装破损、移液器吸头污染、样品外包装污染、操作台面清洁不足、人员操作不规范等。

六、食品颗粒与菌落的区分

一些食品样品稀释液中会带有颗粒，如奶粉、坚果粉、调味粉、果肉、谷物碎屑、乳制品沉淀等。这些颗粒在平板中可能与菌落混淆，尤其在倾注法中更明显。

可采用样品颗粒对照进行辅助判断，即将样品稀释液与培养基混合后不培养，低温放置，计数时与培养后的平板对比。这样可区分原有食品颗粒和培养后形成的菌落。

TTC 等显色辅助方法可使部分细菌菌落呈红色，有助于区分食品颗粒和菌落。但是否可使用显色剂，应以标准方法、实验室验证和产品适用性为准。显色剂可能影响部分菌生长，不应随意加入常规检测体系。

七、菌落计数的选择原则

菌落总数计数通常选择适宜计数范围内的平板。传统平板计数常以 30～300 CFU 为适宜范围。若只有一个稀释度的平板落入适宜范围，可取该稀释度平行平板平均值，乘以相应稀释倍数计算结果。

若两个连续稀释度均在适宜范围内，通常按公式计算：

N = ∑C / [(n₁ + 0.1n₂) × d]

其中，N 为样品中菌落数；∑C 为所有可计数平板菌落数之和；n₁ 为第一稀释度平板数；n₂ 为第二稀释度平板数；d 为第一稀释度的稀释因子。

例如，低稀释度两个平板分别为 232、244，高一稀释度两个平板分别为 33、35，第一稀释度为 10⁻²，则：

N = (232 + 244 + 33 + 35) / [(2 + 0.1×2) × 10⁻²]
= 544 / 0.022
≈ 2.5 × 10⁴ CFU/g 或 CFU/mL。

计算时应注意稀释因子和稀释倍数的表达，避免把 10⁻² 写成 10² 或在换算时颠倒。

八、异常平板如何处理

检测中常见异常情况包括所有平板菌落过多、所有平板菌落过少、平板蔓延、链状菌落、空白对照污染等。

若高稀释度平板菌落数明显高于低稀释度平板，通常提示操作误差、样品混匀不均、移液错误、稀释液污染或样品中存在抑菌因素。此类结果不宜直接用于报告，应结合原始记录和质控情况判断是否重检。

九、链状菌落和蔓延菌落的判断

若平板上出现链状菌落，且菌落之间没有明显界限，可能是样品中菌团在混匀时被拉开形成，也可能是培养过程中昆虫、冷凝水或操作污染造成拖带。通常一条连续链状生长可按一个菌落计，但应结合标准要求和实际形态判断。

蔓延菌落会影响计数准确性。若蔓延面积较小，且其他区域菌落仍可清楚计数，可按标准规定处理；若蔓延严重导致无法判断菌落数，应报告“菌落蔓延”或按方法标准要求处理。平板表面过湿、培养基未充分凝固、样品中运动性强的菌较多、冷凝水滴落等，均可能导致蔓延。

十、菌落过多时能否选 1 cm² 估算

旧资料中提到可在最高稀释度平板上任意选取 2 个 1 cm² 面积估算总菌落数。这种方法在历史资料中可见，但不宜作为现代标准检测的常规推荐。食品微生物检验应优先按现行标准规定处理“多不可计”或不适宜计数平板。

若菌落过多，应通过合理增加稀释度重新检测，获得适宜计数范围内的平板。估算结果仅可作为内部趋势判断或异常调查参考，不宜直接作为正式报告依据，除非对应标准明确允许。

十一、微生物制剂类样品的特殊性

酸奶、发酵乳、益生菌制剂、酵母饮料、发酵饮品等样品含有大量有意添加或自然存在的微生物。此类样品的菌落总数结果需要结合产品标准和检测目的理解，不能简单把所有培养出的菌落都作为污染菌判断。

若标准要求测定特定功能菌、乳酸菌、酵母菌或霉菌酵母，应采用对应方法。若产品本身含活菌，菌落总数可能并不适合作为常规卫生评价指标，或需按产品标准规定解释。

因此，对微生物类食品或发酵食品，应先明确检测项目和判定依据，再决定是否进行菌落总数测定以及如何解释结果。

十二、结果修约和报告

菌落总数结果通常按 CFU/g 或 CFU/mL 报告。称重取样的样品以 CFU/g 表示；体积取样的样品以 CFU/mL 表示。

结果修约应按标准要求执行。通常菌落数小于 100 CFU 时可按整数报告；大于或等于 100 CFU 时可保留两位有效数字，后续位数用 0 表示，也可采用科学计数法表示。例如 24,727 可报告为 25,000 CFU/g，或 2.5×10⁴ CFU/g。

若所有平板无菌落，应以低于检出限形式报告，而不是报告 0 CFU/g。若空白对照有菌落生长，应判定本次检测存在污染风险，结果通常无效。

十三、常见误区

第一，认为菌落总数就是食品中全部细菌数。实际上，它只是规定条件下能形成菌落的微生物数量。

第二，培养基温度越高越好。温度过高会损伤微生物，尤其是受损菌。

第三，平板越薄越省培养基。培养基过薄易干燥，影响菌落生长。

第四，所有食品都用同一培养温度和时间。应按现行标准和产品类型执行。

第五，空白对照只是形式。空白长菌会直接影响检测结果有效性。

第六，菌落太多可以随意估算。正式报告应按标准规则处理，不宜随意选区估算。

第七，发酵食品菌落总数越高越差。需结合产品属性、标准限量和检测目的判断。

第八，所有无菌落都报告 0。更规范的表达通常是低于方法检出限。

十四、小结

菌落总数测定的关键在于样品代表性、稀释准确性、培养基温度和厚度控制、及时倾注、合理培养、正确计数和规范报告。菌落总数反映的是规定方法条件下可形成菌落的微生物数量，不代表食品中全部活菌。检测过程中应设置空白对照，关注食品颗粒干扰、蔓延菌落、链状菌落、过多或过少菌落等特殊情况。现行食品菌落总数测定应关注 GB 4789.2—2022，并按产品类型、检测目的和标准要求选择合适条件。只有过程控制和结果解释同时规范，菌落总数数据才具有可靠的质量评价意义。