DNA-DNA 杂交同源性测定：从传统细菌分类到基因组时代

DNA-DNA 杂交，即 DNA-DNA hybridization，简称 DDH，是经典细菌分类学中用于判断两株细菌基因组整体相关性的重要方法。它曾被视为细菌种水平划分的“金标准”之一，尤其用于判断两个表型相近、16S rRNA 序列相似的菌株是否属于同一个种。

随着全基因组测序成本降低，传统 DDH 已不再是新菌种分类研究中的首选方法。现代微生物分类更多采用平均核苷酸一致性（ANI）、数字 DNA-DNA 杂交（dDDH）和系统基因组学分析。DSMZ 的 TYGS 平台即提供基于基因组的分类分析、dDDH 值和 G+C 含量差异等信息。

一、DNA-DNA 杂交测定的基本原理

DNA-DNA 杂交的核心思想是：如果两株细菌的基因组序列越相似，那么它们的单链 DNA 在适当条件下越容易重新配对形成双链结构；反之，如果差异较大，杂交程度就较低。

传统 DDH 通过比较待测菌株 DNA 与参考菌株 DNA 的复性或杂交比例，估算两者基因组整体相似程度。该方法不是测定某一个基因，而是从全基因组层面对亲缘关系进行评价。

在经典细菌分类中，若两株菌 DNA-DNA 杂交值达到约 70% 或以上，并且其他表型、生理生化和生态特征也相近，通常可支持其归入同一物种。低于该水平，则往往提示可能属于不同种。需要注意，70% 是分类学参考阈值，不是单独决定物种归属的唯一标准。

二、为什么 DDH 曾经重要

在只有形态、生理生化和少量分子标记的年代，很多细菌仅凭显微形态、培养特征、糖发酵、生化反应很难区分。16S rRNA 序列分析出现后，细菌分类精度明显提高，但 16S rRNA 对近缘种的分辨率仍有限，很多不同种之间的 16S rRNA 相似性可达到 97% 甚至 99% 以上。

DDH 的优势在于它反映的是基因组整体相关性，而不是单个保守基因。因此，在全基因组测序普及前，DDH 长期用于新种发表、近缘菌比较和分类地位确认。Richter 和 Rosselló-Móra 在 2009 年的研究中也指出，DDH 曾长期作为原核生物种界定的基因组层面金标准，但在基因组时代已显得过时，需要被可重复性更好的基因组方法替代。

三、传统 DDH 的两类方法

原文提到的两类方法分别是复性率法和固相分子杂交法。二者原理相同，都是比较参考菌株 DNA 与待测菌株 DNA 之间的杂交程度，但检测方式不同。

传统湿实验 DDH 技术要求高，重复性受 DNA 提取质量、片段化程度、变性复性条件、盐浓度、温度、仪器和操作者影响较大。不同实验室之间数据可比性有限，这是其逐渐被 ANI 和 dDDH 替代的重要原因。

四、复性率法如何理解

复性率法利用 DNA 的热变性和复性特性。双链 DNA 经高温处理后解链为单链；当温度、盐浓度和时间合适时，互补序列可重新配对。若两株菌 DNA 序列高度相似，混合 DNA 中异源链也能较好配对，复性速率较高；若差异较大，复性速率较低。

在实验中，通常会分别测定参考菌株 DNA、自身 DNA 以及两者混合 DNA 的复性速率，再通过公式计算杂交百分比。其关键控制点包括 DNA 纯度、片段大小、浓度、复性温度和吸光度测定稳定性。

需要注意，原文中的计算公式存在排版缺失和符号混乱。更适合科普理解的表述是：通过比较混合 DNA 的复性速率与各自 DNA 自身复性速率之间的关系，估算两株菌基因组之间的相关性。实际研究中应采用经确认的方法学公式和软件处理，而不应直接照抄旧资料中的残缺公式。

五、固相分子杂交法如何理解

固相分子杂交法通常将未标记 DNA 固定在硝酸纤维素膜或其他膜材料上，再加入标记后的参考菌株 DNA。若参考 DNA 与膜上 DNA 互补程度高，就会形成较强杂交信号；若互补程度低，则信号较弱。通过比较异源杂交信号与自身杂交信号，可计算相对同源性百分比。

原文中提到的 ¹²⁵I 标记属于早期放射性标记方法。该类方法涉及放射性同位素操作，现代普通食品、药品和培养基实验室通常不再采用。若确需使用放射性标记，必须具备相应许可、辐射防护设施、人员资质和废弃物处置体系。当前研究中更常采用非放射性标记、荧光标记、芯片杂交或直接采用全基因组测序分析。

六、DDH 结果如何判读

传统 DDH 结果通常以百分数表示。常见解释如下：

现代分类研究常将 dDDH 与 ANI 联合使用。一般认为，ANI 约 95%～96% 与 70% dDDH 大致对应，可作为细菌种水平划分的重要参考。

但分类学判断不是只看一个数值。若两个菌株 dDDH 或 ANI 接近阈值，还应综合 G+C 含量差异、系统发育树、基因组质量、表型特征、生态来源、代谢特征和命名法规要求。

七、DDH 与 G+C 含量、16S rRNA、ANI 的关系

细菌分类常采用多相分类思路，即同时利用形态、生理生化、化学分类、生态特征和分子数据。DDH 是其中的基因组相关性指标之一。

G+C 含量差异大，通常提示两株菌亲缘关系较远；但 G+C 含量相近并不能说明它们一定属于同一物种。16S rRNA 相似性高也不能替代 DDH、ANI 或 dDDH。对新种描述和近缘种区分而言，全基因组数据已成为更可靠的证据来源。

八、现代实验室还需要做传统 DDH 吗

多数食品微生物、药品微生物和培养基研发实验室已很少开展传统 DDH。原因包括：操作周期长、DNA 质量要求高、实验误差较大、方法重复性有限、部分方法涉及放射性标记，并且全基因组测序已更易获得。

现在更常见的流程是：

第一，分离获得纯培养物；

第二，进行 16S rRNA 或 MALDI-TOF MS 初步鉴定；

第三，对疑似新种、分类争议菌株或近缘种进行全基因组测序；

第四，计算 ANI、dDDH、G+C 含量并构建系统基因组树；

第五，结合表型和生态信息进行综合分类判断。

TYGS 等平台可基于基因组序列提供 dDDH、G+C 差异和系统基因组分析，用于原核生物分类和鉴定。

九、在培养基和食品微生物中的应用价值

对培养基研发和食品微生物检测而言，DDH 或 dDDH 的主要价值不在日常检测，而在以下场景：

例如，在某些食品污染菌或环境菌研究中，传统生化试验可能无法区分近缘种；此时全基因组 ANI 和 dDDH 能帮助判断其分类地位，避免将不同种误认为同一菌，或将同一种不同菌株误认为不同物种。

十、旧资料中需要特别注意的内容

原文来自早期实验技术资料，具有历史参考价值，但不适合直接作为现代实验室 SOP 使用，主要原因包括：

第一，旧文使用了放射性同位素标记方法，现代普通实验室不应无许可开展。

第二，部分单位、排版和公式存在错误或缺失，例如“0.1SSC”“10SSC”“同源性计算公式”等需要按原始标准方法核对。

第三，传统 DDH 对温度、DNA 片段大小、浓度和仪器要求很高，照搬旧步骤容易得到不可比结果。

第四，现代分类学更推荐使用全基因组数据，传统 DDH 更多作为历史方法理解。

第五，“同源性”一词容易误解为基因功能同源，实际 DDH 指的是基因组整体杂交相关性。

十一、常见误区

第一，认为 DDH 是单个基因比较。DDH 比较的是全基因组层面的整体相关性。

第二，认为 70% 是绝对分界线。70% 是经典参考阈值，边界结果需结合其他证据。

第三，认为 G+C 含量相近就一定同种。G+C 含量只能提供粗略参考。

第四，认为 16S rRNA 高相似性可直接判同种。近缘种常常需要 ANI、dDDH 或系统基因组分析。

第五，认为传统 DDH 结果一定比测序可靠。传统 DDH 操作复杂、重复性有限，现代基因组方法通常更稳定。

第六，认为 dDDH 等同于湿实验 DDH。dDDH 是基于基因组序列的计算估算，结果与传统阈值衔接，但方法学不同。

第七，认为旧实验步骤可直接用于普通实验室。涉及放射性标记、复杂杂交和精密温控的步骤必须满足相应资质和安全要求。

十二、小结

DNA-DNA 杂交曾是细菌种水平分类的重要方法，其核心是通过 DNA 复性或杂交程度评价两株菌的基因组整体相关性。经典分类学中，约 70% DDH 被广泛用作同种判定的重要参考阈值。但传统 DDH 操作复杂、重复性有限，部分方法涉及放射性标记，已逐步被全基因组测序基础上的 ANI 和 dDDH 取代。对现代食品微生物、药品微生物和培养基研发实验室而言，理解 DDH 的历史意义有助于读懂旧文献和菌种分类资料；而在实际分类确认中，更推荐采用高质量基因组测序、ANI、dDDH 和系统基因组学分析，并结合表型特征进行综合判断。