益生菌活菌计数方法比较：稀释液、培养基与培养条件为何会影响结果

益生菌产品的核心质量指标之一是活菌数。无论是益生菌冻干菌粉、固体饮料、颗粒剂、压片糖果，还是含活性乳酸菌的食品，标示的 CFU/g 或 CFU/袋都需要通过可靠的检验方法支撑。活菌计数结果不仅影响产品放行和货架期评价，也影响企业配方设计、稳定性研究、标签标示和监管抽检结果。

但益生菌活菌计数并不等同于“把样品稀释后倒平板”。不同稀释液、培养基、培养气氛、pH、样品基质和菌种组合，都会显著影响检出结果。尤其是高活菌密度冻干菌粉和多菌株复配产品，如果方法选择不当，计数结果可能明显低于实际添加量或批间波动较大。

一、为什么益生菌计数容易不稳定

益生菌产品中的菌体往往经历发酵、浓缩、冷冻、冻干、混合、压片或制粒等过程。虽然这些工艺可以提高产品稳定性，但也会使部分菌体处于应激状态。复水、稀释、接种和培养条件稍有差异，就可能影响其恢复和形成菌落的能力。

影响活菌计数的常见因素包括：

因此，益生菌计数方法应围绕“让菌体充分恢复、均匀分散、在适宜培养基上形成可计数菌落”进行设计。

二、现行标准与企业方法的关系

GB 4789.35—2023 规定了含活性乳酸菌食品中乳酸菌的检验方法，适用于含活性乳酸菌食品的检验。正式监管检验、产品标准执行和标签符合性评价，应优先依据现行有效标准文本。

但在企业研发和质量控制中，标准方法未必能覆盖所有高密度益生菌原料、特殊剂型、多菌株复配产品和新菌株组合。企业可在标准框架下开展方法比较和方法确认，用数据证明某种稀释液、培养基或培养条件更适合本产品。

需要注意：研究性方法可用于内部工艺优化和稳定性评价，但若用于正式放行或标签声称支撑，应确认其与现行标准、产品执行标准、注册备案资料和监管要求一致。

三、稀释液为什么如此关键

益生菌计数中，稀释液不仅是“把样品稀释开”的液体，还承担复水、缓冲、保护细胞和改善分散的作用。冻干菌粉在刚接触水相时最容易受到渗透压、pH、氧和机械剪切影响。若稀释液保护能力不足，菌体可能在接种前已经损伤，导致 CFU 偏低。

原文研究比较了生理盐水和 Mitsuoka’s 缓冲液。Mitsuoka’s 缓冲液通常含磷酸盐缓冲体系、L-半胱氨酸盐酸盐和吐温 80。其作用可概括如下：

研究结果显示，与生理盐水相比，Mitsuoka’s 缓冲液可提高乳杆菌和双歧杆菌冻干粉的计数结果，尤其对双歧杆菌和复配颗粒产品影响更明显。这说明对高活菌密度或酸性益生菌产品，单纯生理盐水可能不是最优稀释体系。

四、pH 对计数结果的影响

益生菌颗粒、固体饮料或冻干菌粉常含有酸味剂、糖醇、益生元、乳粉、膳食纤维或其他辅料。样品复溶后 pH 可能偏酸。乳酸菌虽然耐酸能力强于许多细菌，但“耐酸”不等于“计数时可以长期处于酸冲击状态”。受损菌体在酸性稀释液中可能进一步损伤，导致可形成菌落的数量下降。

原文研究中，益生菌颗粒用生理盐水稀释后 pH 约为 4.41，而用 Mitsuoka’s 缓冲液稀释后 pH 约为 6.56。对于冻干双歧杆菌和乳杆菌复配产品，后者更有利于菌体恢复和后续培养。

因此，益生菌计数方法确认时，应测定样品匀液 pH，并观察不同稀释液对计数结果和重复性的影响。不能只看稀释液是否无菌，还要看它是否适合该菌株和该基质。

五、培养基选择：MRS、TPY 与 RCM 的差异

MRS 琼脂是乳酸菌检验中最常见的培养基之一，适合许多乳杆菌、乳酸球菌和相关乳酸菌生长。但对部分双歧杆菌，尤其是冻干后需要恢复的双歧杆菌，MRS 未必是计数结果最高、最稳定的培养基。

TPY 和 RCM 对双歧杆菌及部分厌氧菌的恢复可能更有优势。原文研究显示，在长双歧杆菌冻干菌粉和乳杆菌-双歧杆菌复配颗粒中，TPY 或 RCM 配合 Mitsuoka’s 缓冲液时，计数结果高于 MRS 体系。这个结果提示：用于总乳酸菌计数的培养基，不一定适合每一个益生菌产品中的每一个目标菌株。

培养基选择应通过本产品、本菌株、本剂型的实测数据确认。不能简单认为“乳酸菌都用 MRS”或“双歧杆菌必须只用某一种培养基”。

六、培养气氛：乳杆菌与双歧杆菌不能一概而论

乳杆菌多为兼性厌氧或微需氧，许多菌株在好氧和厌氧条件下都能生长，因此培养气氛对部分乳杆菌计数影响较小。原文研究中，嗜酸乳杆菌冻干粉在好氧和厌氧培养下计数差异不大。

双歧杆菌则通常对氧更敏感，更适合厌氧培养。若在氧暴露较高的条件下进行稀释、接种和培养，可能导致计数明显偏低。对于含双歧杆菌的产品，稀释液还原性、接种暴露时间、厌氧系统有效性和培养基还原状态都应纳入方法确认。

七、选择性计数：复配产品不能只看总数

多菌株益生菌产品常同时含有乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌或其他益生菌。此时总乳酸菌数只能反映整体可培养活菌水平，不能证明每个菌株或每类菌都达到标示要求。

选择性计数的难点在于：既要抑制非目标菌，又不能过度抑制目标菌。原文研究中，添加莫匹罗星锂盐的改良培养基用于双歧杆菌选择性计数，但不同基础培养基差异明显：改良 RCM 和改良 TPY 结果较高，改良 MRS 结果偏低。

对于复配产品，建议区分三类结果：

差减法虽然操作简便，但误差会叠加。例如“总数减去双歧杆菌数”得到乳杆菌数时，若总数或双歧杆菌数任何一个偏低或偏高，乳杆菌结果都会失真。因此，差减法应谨慎使用，并通过方法确认支持。

八、原文研究结果的启示

该研究比较了两类代表性样品：高活菌密度冷冻干燥菌粉和乳杆菌-双歧杆菌复配益生菌颗粒。其主要结论可概括为：

这些结论说明，稀释液和培养基的组合比单一因素更重要。对双歧杆菌而言，Mitsuoka’s 缓冲液与 RCM 或 TPY 的组合往往比生理盐水与 MRS 的组合更能反映其真实可培养活菌水平。

但该研究也有适用边界：结果来自特定菌株、特定产品和特定实验条件，不能直接推广到所有益生菌产品。其他菌株如鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种等，仍需分别确认。

九、企业建立益生菌计数方法时应怎么做

企业建立益生菌活菌计数方法时，不应只复制标准或论文中的条件，而应开展适用性比较。建议从以下方面设计：

方法确认应覆盖新鲜生产样品和接近保质期末样品。因为保质期末菌体更容易受损，若方法只能适用于新鲜样品，可能无法准确评价产品真实货架期活菌数。

十、培养基研发与质控的关注点

对培养基企业而言，益生菌活菌计数培养基的关键不是“长得快”，而是“目标菌回收高、背景菌干扰少、批间稳定、菌落易计数”。

培养基研发和质控应关注：

对于高活菌密度样品，还要关注平板菌落均匀性和可计数稀释度。菌团分散不良会导致菌落分布不均，造成结果偏低或重复性差。

十一、活菌计数与标签标示的关系

益生菌产品通常以 CFU 标示活菌数。CFU 是菌落形成单位，反映在规定培养条件下能够形成可见菌落的可培养活菌数量。它不等同于全部活细胞数，也不等同于流式细胞仪或显微镜下的细胞数。

因此，标签标示的活菌数应与检验方法匹配。若采用培养法赋值，应明确培养基、稀释液、培养条件和计数规则。若采用流式细胞术、qPCR 或其他快速方法，需要区分总细胞、活细胞、死细胞和可培养细胞，不宜与 CFU 直接混用。

十二、常见误区

第一，认为益生菌计数只要用 MRS 即可。MRS 对许多乳杆菌适用，但不一定适合所有双歧杆菌或复配产品。

第二，认为生理盐水是通用稀释液。对高密度冻干菌粉、酸性颗粒和氧敏感菌，缓冲和还原保护可能更重要。

第三，认为好氧培养能代表所有益生菌。双歧杆菌等厌氧或氧敏感菌通常需要厌氧条件。

第四，认为总乳酸菌数等于每个菌株都达标。复配产品需要关注菌株或菌群构成。

第五，认为选择剂越强越好。选择性过强会抑制受损目标菌，导致低估。

第六，认为生产投料量可以替代实测活菌数。冻干、混合、压片、储存和运输都会造成活性损失。

第七，认为一种方法可覆盖所有剂型。冻干粉、颗粒、饮料、乳制品和油剂产品应分别确认。

第八，认为计数偏低一定是产品问题。也可能是稀释液、培养基、厌氧条件或方法适用性不足。

十三、小结

益生菌活菌计数结果受稀释液、培养基、pH、培养气氛、菌株特性、样品基质和选择剂共同影响。原文研究提示，Mitsuoka’s 缓冲液比生理盐水更适合部分高密度冻干菌粉和益生菌复配颗粒的复水与稀释；对乳杆菌，MRS 或 TPY 在好氧或厌氧条件下均可获得较稳定结果；对双歧杆菌，TPY 或 RCM 在厌氧条件下通常更有优势；对乳杆菌和双歧杆菌复配产品，宜分别建立总乳酸菌、双歧杆菌和乳杆菌的计数方法。企业在建立或修订益生菌活菌计数方法时，应以现行 GB 4789.35—2023 为基础，结合本产品菌株、剂型和货架期样品开展方法确认，用数据证明计数方法的准确性、稳定性和适用性。