枯草杆菌黑色变种芽胞悬液的制备：原理、关键控制点与质量评价

枯草杆菌黑色变种芽胞是消毒试验和灭菌效果评价中常用的细菌芽胞代表。与普通细菌繁殖体相比，芽胞对热、干燥、化学消毒剂和环境胁迫具有更强抵抗力，因此常被用于评价消毒或灭菌过程是否具有足够杀灭能力。

WS/T 683—2020《消毒试验用微生物要求》规定了消毒试验用微生物、培养基、传代与保存、菌悬液和染菌载体制备等要求；其中明确以枯草杆菌黑色变种芽胞作为细菌芽胞代表，常用菌种为 ATCC 9372。该标准为推荐性卫生行业标准，发布于 2020 年 7 月 20 日，实施日期为 2021 年 2 月 1 日。

一、为什么要使用芽胞悬液

消毒试验不能只使用容易杀灭的细菌繁殖体。某些消毒剂或灭菌方法需要证明其对高抗力微生物也有效，此时细菌芽胞就是重要评价对象。枯草杆菌黑色变种芽胞常用于干热、环氧乙烷等消毒灭菌效果相关评价；嗜热脂肪杆菌芽胞则常用于压力蒸汽、过氧化氢气体和低温蒸汽甲醛等灭菌过程评价。WS/T 683—2020 也将不同芽胞菌株与相应灭菌或消毒评价场景进行了对应。

芽胞悬液的制备目标不是单纯获得一瓶“菌液”，而是获得芽胞形成率高、繁殖体残留低、分散均匀、浓度可计数、纯度可确认、保存期受控的标准化试验材料。若芽胞悬液中混有大量营养细胞、菌团或杂菌，消毒试验结果就可能失真。

二、名称和菌株编号要准确

“枯草杆菌黑色变种”是我国消毒试验标准中的常用名称，拉丁名写作 Bacillus subtilis var. niger。但在现代细菌分类学中，生物指示物相关菌株 ATCC 9372/DSM 675 已被重新归类为 Bacillus atrophaeus。LPSN 资料显示，DSM 675 曾用名包括 Bacillus subtilis var. niger，并已作为生物指示物菌株重新分类为 Bacillus atrophaeus。

因此，企业文件可采用如下写法更严谨：

菌株编号比名称更关键。不同来源、不同编号的芽胞菌株抗力可能不同，不能只凭“枯草杆菌芽胞”或“黑色变种”模糊替代。

三、芽胞悬液制备的基本逻辑

标准中的制备过程可概括为十个环节：菌种复苏、纯化传代、扩大培养、诱导形成芽胞、芽胞染色确认、收集菌苔、分散处理、过滤去杂、离心洗涤、杀灭残余繁殖体，最后进行计数和污染确认。

这套流程的核心不是“多培养几天”，而是把芽胞比例、悬液纯度和抗力稳定性控制在可评价状态。

四、复苏与传代：保证菌株状态稳定

芽胞悬液通常不直接由原始冻干菌种制备，而是先复苏、纯化，再用合适代次的培养物进行后续培养。WS/T 683—2020 中的流程使用复苏后的培养物继续传代，并规定在传代时标注菌种名称、菌种号、代数和传代日期等信息。

传代管理要注意三点：

第一，菌株来源要可靠。应来自有资质的菌种保藏机构，并能通过常规方法进行鉴定。

第二，代次要受控。用于制备芽胞悬液的培养物应在标准或企业 SOP 规定范围内，不能长期连续传代后继续使用。

第三，典型菌落要确认。若平板上出现形态混杂、污染可疑、颜色异常或生长状态不一致，应重新纯化或重新启用保藏菌株。

五、芽胞形成率是核心指标

芽胞悬液是否可用，首先要看芽胞形成率。若营养细胞比例过高，后续热处理和消毒试验都会受到影响。WS/T 683—2020 采用改良芽胞染色法观察芽胞形成情况，并要求在显微镜下确认芽胞形成率达到规定要求后再进行后续处理。该标准中，芽胞染色后芽胞呈绿色、菌体呈红色，芽胞形成率达到 90% 以上方可继续处理。

芽胞形成率不足时，常见原因包括：

因此，芽胞制备不应只按时间终止，而应以显微镜下芽胞形成率和形态确认作为关键放行条件。

六、改良芽胞染色的作用

芽胞染色用于区分芽胞和营养细胞。普通革兰氏染色不能可靠显示芽胞比例，因为芽胞结构致密、染色性不同。改良芽胞染色通常使用孔雀绿使芽胞着色，再用沙黄复染营养细胞，从而在油镜下观察芽胞和菌体比例。

判读时应关注：

如果视野中红色营养细胞过多，说明芽胞形成不足或后续处理前不宜使用。若存在不同形态菌体，应考虑污染风险。

七、收集、分散和洗涤的意义

芽胞形成后，需要将培养基表面的菌苔收集成悬液。这个过程容易带入琼脂碎屑、培养基残留和菌团，因此后续必须进行分散、过滤和洗涤。

分散处理的目的，是使菌链、菌团和黏附在琼脂碎屑上的芽胞尽量变成均匀悬浮状态。若芽胞聚集严重，活菌计数会偏低，染菌载体负载也会不均匀。

洗涤的目的，是去除培养基营养成分、代谢产物和有机物残留。消毒试验中有机物会消耗消毒剂或改变杀灭效果，若芽胞悬液清洗不充分，可能使消毒剂效力被低估或结果波动增大。

八、为什么要处理残余繁殖体

芽胞悬液中若残留大量营养细胞，会使试验对象不再是“芽胞抗力”，而混入了较易杀灭的繁殖体。标准流程中通过适当热处理去除残余细菌繁殖体，保留耐热芽胞。WS/T 683—2020 明确提出处理后冷却、混匀、分装并冷藏保存，使用时先进行活菌培养计数。

这一步的质量控制重点包括：

因此，热处理条件、容器体积、悬液浓度、混匀方式和冷却过程都应在企业 SOP 中受控。

九、活菌计数和浓度确认

芽胞悬液使用前应进行活菌培养计数。计数结果用于确定实际 CFU 水平，并为后续消毒试验、载体染菌或悬液定量杀灭试验提供依据。标准也要求芽胞悬液在使用时先进行活菌培养计数。

计数时应特别注意芽胞聚集问题。若芽胞未充分分散，一个菌团可能只形成一个菌落，导致 CFU 低估。若稀释、混匀或涂布不均，平行平板差异会增大。

建议关注以下指标：

十、污染确认与身份核查

芽胞悬液保存和使用过程中若怀疑污染，应通过菌落形态、显微镜检查、革兰氏染色和生化试验等方法进行确认。WS/T 683—2020 也要求怀疑污染时采用菌落形态、革兰染色与生化试验等方法鉴定。

典型异常包括：

正式试验中，一旦发现芽胞悬液污染或身份异常，应停止使用，并追溯已使用该悬液的试验结果。

十一、保存期不能只看标准上限

原文中提到芽胞悬液冷藏保存备用、有效使用期 6 个月。实际管理中，6 个月应理解为标准条件下的使用期要求或参考上限，企业仍应建立保存期内稳定性确认。尤其是自制芽胞悬液，不同制备批次、洗涤程度、分装体积、容器密封性和冷藏条件都会影响活菌数稳定性。

保存期验证应至少关注：

若保存期内出现污染、浓度明显下降、性状异常或芽胞率不符合要求，应停止使用并销毁。

十二、培养基企业和检测实验室的关注点

对培养基企业而言，枯草杆菌黑色变种芽胞悬液制备涉及营养肉汤、营养琼脂、芽胞染色试剂、稀释液和计数培养基等多个环节。任何一个培养基批次性能不稳定，都可能导致芽胞形成率低、菌苔质量差、计数不稳定或污染判断困难。

对检测实验室而言，应把芽胞悬液作为受控关键试验材料管理，而不是普通菌液。其制备批号、来源菌株、代次、芽胞率、活菌数、纯度、保存期和使用记录均应可追溯。

十三、常见误区

第一，认为芽胞悬液就是普通菌悬液。芽胞悬液强调芽胞率、抗力和繁殖体去除，不只是菌数。

第二，认为培养时间到了即可收集。应以芽胞染色确认芽胞形成率为关键依据。

第三，认为芽胞越多越好。浓度过高但分散性差，会导致计数和染菌不均匀。

第四，认为热处理只是灭菌。此处热处理目的是去除残余繁殖体，而不是杀灭芽胞。

第五，认为过滤只是为了澄清。过滤主要用于去除琼脂凝块和大颗粒，改善悬液均匀性。

第六，认为保存 6 个月内一定稳定。自制悬液仍需保存期内计数和纯度验证。

第七，认为菌名相近即可替代。消毒试验应使用标准规定菌株或经确认抗力相当的菌株。

第八，认为菌落形态正常就不需要鉴定。怀疑污染或结果异常时，应结合染色和生化等方法确认。

十四、小结

枯草杆菌黑色变种芽胞悬液是消毒试验中评价细菌芽胞抗力的重要试验材料。其制备过程的关键不在于简单扩大培养，而在于获得芽胞形成率高、繁殖体残留低、分散均匀、纯度可靠、浓度明确且保存稳定的芽胞悬液。实验室应依据 WS/T 683—2020 和经验证 SOP 管理菌株来源、代次、培养基、芽胞染色、收集洗涤、热处理、活菌计数、污染鉴定和保存期。对于培养基生产和微生物检测机构而言，芽胞悬液的质量直接影响消毒试验结果的可信度，应作为关键质控材料进行全流程管理。